HPV的定量和分型檢測在ASCUS分流診斷中的作用比較

孟 瑜，吳 丹，李柱南，許 穎，陳 憶，林 婧

(上海交通大學醫學院附屬國際和平婦幼保健院宮頸疾病診療中心，上海 200030)

宮頸癌是中國女性最常見的癌癥之一。根據國家癌癥中心2016年公布的數據顯示：宮頸癌是我國第二大女性惡性腫瘤。2015年，我國宮頸癌新發及死亡病例數分別為9.89萬例及3.05萬例[1]。目前，宮頸細胞學檢查和高危型人乳頭瘤病毒(high-risk human papillomavirus，HR-HPV)的檢測被用于篩查宮頸癌前病變和宮頸癌。盡管存在宮頸細胞學檢查異常的指南共識，但臨床工作中仍存在許多問題。例如意義不明的非典型鱗狀細胞 (atypical squamous cells of undetermined significance，ASCUS)的組織病理學檢查結果涵蓋了從炎癥、宮頸上皮內瘤變 (cervical intraepithelial neoplasia，CIN) 到浸潤性宮頸癌，臨床上如何加強ASCUS患者的管理并給予個體化處理是亟待解決的難題。

ASCUS是宮頸細胞學 (The Bethesda system，TBS) 分類中一種較為含糊的類別，指形態改變較良性反應性改變明顯，但在數量和程度上又不足以診斷為鱗狀上皮內病變的一組陰道、宮頸的細胞學病理改變。可能與許多因素有關，如急、慢性炎癥，霉菌，陰道毛滴蟲，HPV等刺激有關，也有一些是修復性細胞、化生性細胞、萎縮性細胞、少數或個別不典型的鱗癌、腺癌細胞等；制片的薄厚(細胞覆蓋的量)、染色的深淺度及炎癥細胞的多少都會影響到診斷[2]。ASCUS的診斷個體差異性很大，臨床上難以做出準確的、可重復性判讀。

HR-HPV檢測有助于ASCUS的診斷和治療，現已被推薦為ASCUS分流診斷的主要手段。目前有兩種HR-HPV檢測技術應用于宮頸癌篩查：HC2定量檢測(Qiagen)和Cobas分型檢測(Roche)，分別于2003年和2011年獲得美國食品藥品管理局的批準。然而，在中國大部分地區居民收入較低的情況下，限制了使用這些昂貴的檢測手段進行大規模的宮頸癌初級篩查。本研究的目的是探索和比較HR-HPV定量和分型檢測在ASCUS分流診斷中的價值。

1資料與方法

1.1研究對象

選擇2015年1月至2017年12月在上海交通大學醫學院附屬國際和平婦幼保健院就診的3 607名通過液基細胞學(liquid-based cytology，LCT)檢測結果為ASCUS的病例，同時進行HR-HPV定量或分型檢測，隨后進行陰道鏡檢查并做組織病理學活檢。作者在收集資料過程中，可獲取用于識別所有對象的個體信息。納入標準是：①有性生活史且非妊娠狀態；②LCT檢測結果為ASCUS；③HR-HPV與LCT同時檢測；④LCT檢查后兩個月內進行陰道鏡檢查及組織病理學活檢。排除標準為：①我院缺失或未進行LCT、HR-HPV或陰道鏡活檢的數據；②LCT檢查前三天有急性生殖道炎癥、性生活、陰道沖洗或陰道用藥；③宮頸手術史：如宮頸激光手術、宮頸錐切術、全子宮切除術、放療或化療；④其他生殖器腫瘤；⑤不完整的臨床數據。

對所有受試者進行病理學檢查結果隨訪，收集年齡、絕經狀態、孕次、產次、HPV檢測結果和組織病理學活檢結果并進行統計學分析。本研究經過上海交通大學醫學院附屬國際和平婦幼保健醫院倫理委員會批準(批準編號：GKLW2015-28)。所有受試者均同意參加并簽署了知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1液基細胞學檢測

使用Auto Cyto Prep自動芯片染色機(Tri Path，City，ST，USA)處理LCT細胞學。 細胞學合格的婦科醫生根據國際癌癥協會的Bethesda系統(TBS；2001)的細胞學診斷標準進行診斷。

1.2.2 HR-HPV檢測

對所有在2015年12月及之前的受試者，HR-HPV的檢測是使用DML2000基因雜交信號放大系統第二代混合輔助技術(HC2)，使用HC2-HPV檢測試劑盒(Digene，City，ST，USA)進行定量檢測13種類型的HR-HPV (包括-16、-18、-31、-33、-35、-39、-45、-51、-52、-56、-58、-59和-68)。HR-HPV DNA≥1.00pg/mL被認為是陽性，結果為定量檢測，但不分型。

2016年1月及之后的受試者，HR-HPV使用Cobas 4800檢測系統和試劑(Roche，Basel，Switzerland)，通過聚合酶鏈反應進行基因分型可檢測出14種HR-HPV(包括HPV-16、-18、-31、-33、-35、-39、-45、-51、-52、-56、-58、-59、-66和-68)，并將HR-HPV分類為HPV-16、HPV-18或其他12種類型之一。含有一種或多種類型的陽性被認為是HR-HPV陽性(HPV-16和-18分別為300和600拷貝/mL)，但不測定HR-HPV定量。

1.2.3陰道鏡檢查和組織活檢

由經驗豐富的陰道鏡專家進行陰道鏡檢查、宮頸活檢和子宮頸管內膜刮取術(endocervical curettage ，ECC)。用棉簽在患者宮頸表面處將其分泌物擦拭干凈，然后對患者的宮頸鱗柱交界處進行檢查，取3.00%的醋酸溶液抹在患者宮頸表面處維持1分鐘后再觀察，最后實施碘溶液試驗工作，確定病變范圍并取多點活檢，進行圖像評估，做出診斷。如果陰道鏡檢查成像不滿意，則進行ECC。所有標本均送病理組織學檢查，病理診斷結果包括宮頸炎、CIN1、CIN2、CIN3、鱗癌及腺癌。CIN2及以上病變的病理學診斷定義為CIN2+。

1.3統計學方法

本研究數據采用SPSS 21.0(IBM Corp，Armonk，NY，USA)進行統計學分析。定量資料先行正態性檢驗，符合正態分布的定量數據用均值±標準差表示，使用兩獨立樣本t檢驗進行比較；非正態分布數據用中位數(范圍)表示，并使用Mann-WhitneyU檢驗進行比較。定性數據用百分比表示并使用卡方檢驗進行比較。先行單因素分析，將有統計學意義的因素作為多因素分析的因變量進行Logistic回歸。以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1病例特征

3 607例ASCUS病例的平均年齡為40.73±11.65歲(17～81歲)。其中27.47%(991/3 607)進行HR-HPV定量檢測，72.53%(2 616/3 607)進行HR-HPV分型檢測。在陰道鏡檢查中，79.60%(2 871/3 607)的病理組織學診斷為正常，20.27%(731/3 607)存在CIN，其中16.14%(582/3 607)病例診斷為CIN1和4.13% (149/3 607)病例為 CIN2及以上病變，0.14%(5例)病例被診斷為宮頸癌。

2.2 HR-HPV感染和宮頸病變按年齡分組比較

所有受試者的HR-HPV檢測結果和宮頸活檢病理學診斷結果按年齡分組的統計結果如表1所示。根據組織病理學診斷結果將患者分為兩組：正常/ CIN1和CIN2+/宮頸癌。30歲以下人群中HR-HPV感染陽性率和CIN2及以上病變的發生率最高， 隨著年齡的增長而下降，見表1。

表1 按年齡對HR-HPV感染和宮頸病變的比較[n(%)] Table 1 Comparison of HR-HPV infection and pathological results among different age groups [n(%)]

2.3與ASCUS分流診斷相關的單因素分析

單因素分析顯示兩組的年齡，絕經狀態和HR-HPV感染情況存在顯著差異(P<0.05)，提示年輕，絕經前狀態和HR-HPV感染的ASCUS患者更易發生CIN2及以上病變，見表2。

表2 年齡、絕經狀態和HR-HPV感染與ASCUS分流診斷之間的關系Table 2 Relationships of age，menopausal status and HR-HPV infection with ASCUS triage diagnosis by univariate analysis

2.4 ASCUS分流診斷中HR-HPV定量和分型檢測的價值比較

基于HR-HPV定量檢測而言，HR-HPV病毒載量在宮頸高級別和低級別病變的患者之間沒有顯著差異(t=0.88，P=0.38)；基于HR-HPV分型檢測而言，HPV-16或-18型陽性的患者相比其他12種HPV陽性患者，更易發生CIN2及以上病變(χ2分別為133.24，7.60，2.52，P均<0.05)，表明HR-HPV分型檢測對ASCUS的分流診斷具有價值,見表3。

表3 HR-HPV定量和分型檢測在ASCUS分流診斷中的價值比較Table 3 Values of HR-HPV quantification and genotyping in triage diagnosis of ASCUS

2.5與ASCUS分流診斷相關因素的多因素分析

將單因素分析中有統計學意義的指標，即絕經狀態、年齡、HR-HPV感染、HPV-16和HPV-18型陽性納入多因素logistic回歸模型中。結果顯示只有HR-HPV感染、HPV-16陽性和HPV-18陽性是CIN2及以上病變的獨立危險因素(95%CI：1.25～14.12，P=0.02；95%CI：4.88～14.04，P<0.01；95%CI：1.06～5.28，P=0.04)。這些結果表明HR-HPV分型檢測才是具有價值的ASCUS分流手段，見表4。

表4 與ASCUS分流診斷相關的多因素Logistic回歸分析Table 4 Factors associated with triage diagnosis of ASCUS by multifactorial logistic regression analysis

3討論

3.1 ASCUS分流診斷的意義

目前宮頸細胞學檢查仍占宮頸癌篩查的主導地位，但在中國，由于病理醫生尤其是細胞學醫師的診斷水平參差不齊，細胞學結果并未被視為最重要的診斷依據。臨床上當細胞學檢查提示為ASCUS時，可能是宮頸細胞增生活躍的良性改變，也可能是潛在的惡性病變，臨床醫師難以對其進行明確分類。本研究的目的是評估HR-HPV檢測用于ASCUS合并CIN2及以上宮頸病變的診斷價值，以便提供及時和適宜的治療。2001年在美國啟動了 ALTS (ASCUS-LSIL Traige Study) 即 ASCUS 及LSIL分流研究推薦了三種常用分流方法：①6個月后重復子宮頸細胞學檢查，再次為ASCUS的患者推薦行陰道鏡檢查；②進行HR-HPV檢測，結果陽性的患者推薦行陰道鏡檢查；③直接行陰道鏡檢查。研究發現單次的HR-HPV檢測可發現和診斷92.40%的CIN3患者，與直接行陰道鏡檢查具有相同的敏感性，但僅使一半的患者接受陰道鏡檢查[3]。最新的研究分析了2011年至2015年間我國ASCUS患者的HR-HPV檢測和組織學隨訪情況，ASCUS的發生率為3.77%(83 199/2 206 588例)，ASCUS患者中HR-HPV陽性率為34.98%(6 498/18 574例)，ASCUS合并HPV陽性的婦女CIN2及以上的檢出率為13.98%，明顯高于HPV陰性的婦女(2.84%)[4]。宮頸鱗癌的檢出率為3.95%。

本研究中3 607例ASCUS患者的陰道鏡活檢病理學結果顯示：79.60%的病例未見異常，20.27%是CIN或宮頸癌(其中CIN 1占16.14%，CIN2及以上病變占4.13%；宮頸癌占0.14%)。這些數據表明當宮頸細胞學檢查提示為ASCUS的患者需要進一步評估：若只進行常規觀察隨訪會遺漏部分宮頸高級別病變甚至宮頸癌；若對所有ASCUS患者進行陰道鏡檢查又會大大增加醫生工作量及患者的經濟負擔和精神壓力。研究發現陰道鏡檢查能會增加患者的焦慮情緒并對其未來的生育能力和生活質量產生不利影響[4]。因此，綜合考慮個體化的ASCUS分流診斷策略對早期發現宮頸病變至關重要。最佳分流策略必須確定可能發展為宮頸浸潤癌的癌前病變，同時避免過度檢測和不必要的短暫HPV感染治療。

3.2 ASCUS分流診斷中的年齡因素

研究顯示2011年至2015年間在接受ASCUS(Papanicolaou)Pap檢測聯合HPV檢測的18 574名女性中，HR-HPV陽性率為34.98%(6 498/18 574例)，其中30歲以下女性的感染率最高[5]。性活躍的年輕女性可能有更多機會造成子宮頸上皮的損傷，如果有多個性伴侶，則容易發生多種HPV感染。隨著年齡的增長，獲得性免疫力增加，HPV暴露風險普遍降低，感染率隨之降低。這些觀察結果解釋了在本研究中3 607例ASCUS患者中CIN2及以上病變在30歲以下患者中發生率最高，而隨著年齡的增長發生率則呈下降趨勢。

3.3 HR-HPV感染在ASCUS分流診斷中的價值

持續的HR-HPV感染是發生CIN與宮頸癌的生物學病因，也是與宮頸病變進展相關的主要因素。有效的HR-HPV定量或分型檢測可能在宮頸癌的預防和治療中發揮重要作用。HPV采用HC2(Qiagen)或Cobas(Roche)檢測具有相似的準確性和良好的一致性[6]，因此兩者均可用于評估臨床中的HR-HPV感染。由于其高靈敏度和陰性預測值，HR-HPV的檢測一直以來被認為是ASCUS分流管理的理想方法。

有研究分析ASCUS患者在6個月內的組織學結果，其中CIN2及以上病變的檢出率為7.87%(473/6 012例)，ASCUS合并HPV陽性的婦女中CIN2及以上病變的檢出率為13.98%，明顯高于HPV陰性的婦女(2.84%)[5]。本研究發現HR-HPV陽性的ASCUS患者中CIN2及以上病變的檢出率為5.52%，HR-HPV陰性的ASCUS患者中CIN2及以上病變的檢出率為0.55%，表明HR-HPV陽性與ASCUS中CIN2及以上病變的風險顯著相關，進一步表明ASCUS分流診斷中HR-HPV檢測具有比重復細胞學更高的敏感性。

因此，我們認為HR-HPV檢測有助于ASCUS的分流診斷，HR-HPV陽性患者需要進行陰道鏡檢查。HR-HPV陰性的患者可以減少陰道鏡檢查的數量，減少隨訪工作壓力，并且可以相對安全地延長臨床篩查的間隔時間。

3.4 ASCUS分流診斷中HR-HPV定量和分型檢測的價值比較

目前已經檢測到超過100種類型的HPV，按照 HPV與宮頸癌的關系，將HPV基因型分為高危型、中間型和低危型，其中15種為高危型(16、18、31、33、35、39、45、 51、52、56、58、59、68、73和82)。研究發現上海地區女性宮頸HPV總感染率為33.6%，高危型 HPV感染中居前六位的依次是HPV-16、52、58、53、33、18；低危型HPV感染中居前三位的依次是HPV-81、11、6。有病理組織學結果的宮頸病變組HPV總感染率為41.9%，其中宮頸低級別病變組HR-HPV感染中居前五位的依次是HPV-16、58、52、18、33；宮頸高級別病變組HR-HPV感染中居前五位的依次是HPV-16、58、33、18、52[7]。因此，HR-HPV分型檢測在宮頸癌篩查中至關重要。

目前HR-HPV檢測已被推薦為ASCUS分流診斷的主要手段，但其特異性仍有待加強。我們發現相比于HR-HPV定量檢測，HR-HPV分型檢測在ASCUS分流診斷中更具優勢。 HPV-16和-18陽性是宮頸高級別病變的獨立危險因素。因此，HPV-16和HPV-18陽性患者應進行陰道鏡檢查和組織病理學活檢以免漏診，且需要密切的臨床隨訪。總之，HR-HPV分型檢測可以實現高質量的ASCUS分流診斷，并可為建立ASCUS分流管理策略提供可靠的依據。

3.5本研究的局限性

因宮頸癌的發展不僅與持續的HR-HPV感染有關，還與年齡、吸煙、性伴侶數量、自身免疫力下降(如HIV感染)和使用長期口服避孕藥有關。 因此，僅憑HR-HPV檢測來預測宮頸癌的發展可能缺乏客觀性和特異性，需要加入以上干擾因素進行模型調整，期待日后有多中心、大樣本的前瞻性臨床研究來建立更有效的ASCUS分流方案。

綜上所述，優化宮頸癌篩查的目的是為了提高效率、避免誤診、減少過度診斷和治療，并降低宮頸癌的發病率。我們建議ASCUS的分流診斷應該是個體化的，細胞學家不應該將ASCUS視為模糊診斷，臨床醫生應該仔細評估ASCUS，并盡快做出明確的診斷，以免誤診及延誤治療。HR-HPV分型檢測有助于ASCUS的分流診斷，有助于宮頸高級別病變的早期篩查。鑒于HPV-16或-18感染的宮頸病變進展風險較高，可將HPV-16或-18陽性視為ASCUS患者分流的特異性標記，而非HPV的定量檢測。HPV-16 或-18 陽性的患者建議進一步行陰道鏡檢查，其他HR-HPV陽性的患者可以選擇定期隨訪，當然，臨床上應靈活應用篩查手段，對于那些具有宮頸癌高危因素和隨訪困難的患者，仍可直接使用陰道鏡檢查和組織病理學活檢來確診。