內蒙古地區漢族PKU患兒苯丙氨酸羥化酶基因突變分析

侯麗青，冀云鵬，朱 博，侯東霞，武麗瓊，王曉華

(內蒙古自治區婦幼保健院遺傳科，內蒙古 呼和浩特 010020)

苯丙酮尿癥(phenylketonuria，PKU)是由于苯丙氨酸羥化酶(phenylalanine hydroxylase，PAH)缺乏所致的一種嚴重的遺傳性氨基酸代謝障礙性疾病，呈常染色體隱性遺傳。隨著新生兒疾病篩查的開展，越來越多的PKU患兒得到了早期診斷和治療，避免了智能發育落后的發生。PKU發生率及基因突變的種類和頻率在不同地區、不同民族差異較大，表現出極大的遺傳異質性。內蒙古地處中國中西部，人口以漢族、蒙族為主，漢族人口約占78%，為探究內蒙古地區漢族PAH基因突變的規律及特點，本研究對內蒙古地區確診的26例漢族PKU患兒及其父母進行PAH基因突變分析，報告如下。

1材料與方法

1.1材料

收集2015年1月至2018年10月在內蒙古自治區婦幼保健院經新生兒疾病篩查及遺傳咨詢門診確診的26例PKU患兒為研究對象，男17例，女9例，年齡0～18歲。26例患兒來自內蒙古各地，均為漢族。所有受試患兒家長均簽署知情同意書。

采集患者血液及尿液標本進行血二氫蝶呤還原酶測定、BH4負荷試驗(Phe濃度>600μmol/L)或Phe和BH4聯合負荷試驗(Phe濃度≤600μmol/L)，以及尿蝶呤譜分析，排除四氫生物蝶呤缺乏癥、一過性高苯丙氨酸血癥和酪氨酸血癥患者。對Phe濃度>600μmol/L患兒行低苯丙氨酸飲食控制治療。

1.2標本采集及DNA提取

采集患兒及其父母外周靜脈血2mL，滴于濾紙上呈3～5個濾紙斑，陰涼干燥避光處晾干，1～2h后裝入無菌干凈密封袋內備用。采用快速酚氯仿抽提法提取血斑DNA，將卡片沿血滴四周剪下，用1×TE緩沖液500μL和800μL NaCl(250mmol/L)洗滌1次，加入200μL消化緩沖液(pH=8.0的100mmol/L Tris、20mmol/L EDTA、150mmol/L NaCl、2%SDS)和5μL蛋白酶K，65℃下水浴1h。不取出血片直接在消化液中加200μL飽和酚—氯仿—已戊醇(25∶24∶1)，提取基因組DNA。

1.3 PCR擴增及序列測定

PAH基因第1～13外顯子區域及內含子與外顯子交接區引物序列，見表1。PCR擴增見表2，產物純化及序列測定由華大基因公司完成，每個突變都采用正、反向測序證實，檢測患者父母DNA序列，以確定序列變異來源。

表1 PAH基因各外顯子引物序列Table 1 Sequences of each exons’ primers of PAH gene

表2 PCR反應體系和擴增程序Table 2 PCR system and amplification program

注：*根據合成引物的退火溫度，PCR擴增時調整相應的退火溫度。

1.4突變命名和驗證

已知突變的命名結合測序結果并參照http://www.biopku.org/pah提供的突變名稱命名。新突變通過查閱PAH相關數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov、http://www.biopku.org/pah等)并且排除多態性位點后，才被認定為新突變。新突變的命名參照http://www.hgvs.org/mutnomen提供的命名法來命名。

1.5統計學方法

應用SPSS 17.0統計學軟件對數據進行統計學分析，計數資料以例數(n)及率(%)表示，組間比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1 PAH基因突變在患者中的分布

在26例患者的52個PAH等位基因中共檢測到46個突變等位基因，總檢出率為88.5%。17例患者攜帶復合雜合突變基因，其中3例患者攜帶3個突變基因，14例患者攜帶2個突變基因；9例患者攜帶單雜合突變基因，見表3。

2.2內蒙古地區PAH基因突變類型及特點

26例患者中共檢出24種PAH基因突變，包括16種錯義突變(66.7%)、5種剪接突變(20.8%)、2種無義突變(8.3%)和1種缺失突變(4.2%)。24種突變等位基因分布在PAH第2～3、6～8、10～12外顯子和第4、7、12內含子中，突變頻率最高的是第7外顯子，占23.1%(12/52)，其次是第12外顯子，占13.5%(7/52)，第6、11外顯子分別占11.5%(6/52)，第3外顯子占7.7%(4/52)，第12內含子占7.7%(4/52)，第4內含子占5.8%(3/52)，這7個熱點突變區域占總突變的80.8%(42/52)。46個被檢出的等位基因中R243Q突變發生頻率最高(13.5%)，其次為Y356X(9.6%)、Y204C(5.8%)、R241C(5.8%)、R413P(5.8%)、IVS12+6T>A(5.8%)、I65S(3.8%)、IVS4-1 G>A(3.8%)、H170Q(3.8%)、L430P(3.8%)，這10種突變占總突變的61.5%(32/52)，見表4。

表3 PAH基因突變在26例患者中的分布Table 3 Distribution of PAH gene mutations in 26 Han ethnic PKU patients

表4 內蒙古地區26例PKU患者PAH基因突變檢測結果Table 4 Detection results of PAH gene mutations of 26 Han ethnic PKU patients in Inner Mongolia

2.3內蒙古與西北五省漢族PAH基因常見突變比較

內蒙古地區漢族與西北五省類似，居于首位的PAH突變都為R243Q，但內蒙古地區漢族R243Q突變檢出率明顯低于陜西地區漢族(χ2=3.845，P<0.05)。其他常見突變構成明顯區別于西北五省，Y365X檢出率明顯高于陜西地區漢族(χ2=5.674，P<0.05)和甘肅地區漢族(χ2=4.031，P<0.05)，Y204C和IVS12+6T>A在西北五省中均未見檢出，然而在西北五省中突變頻率較高的EX6-96A>G在內蒙古地區漢族中未檢出，見表5。

表5 內蒙古地區漢族與西北五省PAH基因常見突變頻率比較(%)Table 5 Comparison of common mutations’ frequency of PAH gene in the Han ethnic group between Inner Mongolia and the five provinces of northwest China (%)

注：*P<0.05。

3討論

3.1內蒙古地區漢族PAH突變檢出率較低的原因分析

本研究對內蒙古地區26例漢族患者PAH基因的13個外顯子區域及其與內含子連接區域測序分析，發現PAH突變檢出率為88.5%，與陜西地區漢族[1](89.1%)、新疆地區漢族[5](90.1%)相比，突變檢出率較低，但高于甘肅地區漢族[2](77.6%)、寧夏地區漢族[3](75%)和青海地區漢族[4](85.9%)。分析認為一方面原因可能與采用的方法有關，本研究僅用PCR擴增及測序一種方法，如聯合應用高分辯溶解曲線和多重連接依賴探針擴增(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)技術，可顯著提高PAH突變基因的檢出率；另一方面可能是某些基因突變在本方法檢測區域之外，如與基因表達密切相關的啟動子、順式作用元件、反式作用因子和深度內含子區域等，這可能也是部分患兒未完全檢測出突變的原因。

3.2內蒙古地區漢族PAH基因突變分布特點及突變熱點

本研究發現內蒙古地區漢族PKU患兒的PAH基因突變主要分布在第7、12、6、11、3外顯子和第12、4內含子，與中國北方漢族人群PAH突變分布基本一致[6]，與歐洲人更多集中在第3、10、12外顯子明顯不同[7]，這充分說明內蒙古地區漢族PAH基因突變既具有保守性又有高度異質性的特征。另外，研究還發現R243Q在內蒙古地區漢族檢出率最高，與陜西、山西、新疆等中國北方地區一致[8-10]，但區別于中國南方地區，江蘇地區檢出率最高的為R241C(11%)和EX6-96A>G(6%)[11]，廈門和我國臺灣地區檢出率最高的為R241C[12-13]，表明PAH基因突變在中國南方和北方地區存在顯著差異。另外，本研究發現內蒙古地區漢族檢出率較高的突變Y204C和IVS12+6T>A，在西北五省均未檢出，R241C在甘肅、寧夏、青海地區漢族中均未檢出，在陜西和新疆地區漢族中雖有檢出但突變率也較低(1.02%和3.5%)，提示這3種突變可能是內蒙古地區漢族人群特殊的PAH突變類型。本研究也提示內蒙古地區漢族PAH基因突變已形成具有鮮明地域特征的分布規律和特點，這對內蒙古地區漢族PKU患兒的診斷和產前診斷具有重要價值。

3.3內蒙古地區漢族PAH基因新突變

本研究還發現了2種PAH基因新突變c.1065G>T(Q355H)和c.1316-286A>C，經檢索國際PAH基因突變數據庫(截至2018年12月)，確認為中國人群中存在的國際上首次發現的PAH基因新突變。c.1065G>T突變位于PAH催化區，由于第1 065位核苷酸鳥嘌呤突變為胸腺嘧啶，導致第355位編碼谷氨酰胺的密碼子(CAG)變成了編碼組氨酸的密碼子(CAT)，改變了PAH的結構并影響了酶的活性功能。c.1316-286A>C是其中一個患兒中檢測到的唯一突變，該突變如何影響酶蛋白功能還需我們進一步研究。

3.4小結

內蒙古地區檢出的PAH基因突變特點復雜多樣，既包含我國北方地區的常見突變類型，也與西北各省區基因突變分布特征有所不同。本研究分析了內蒙古地區漢族PAH基因的突變類型、頻率及特點，為內蒙古地區漢族PKU患者篩查提供了數據資料，同時對本地區有效降低PKU發病率，提高人口素質具有重要意義。