一種黑木耳棚室栽培病害病原菌鑒定

劉佳寧，馬銀鵬，張丕奇，馬慶芳

(黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，哈爾濱 150010)

木耳(Auriculariaheimuer)[1]別名黑木耳、光木耳，其子實(shí)體膠質(zhì)，色澤黑褐，質(zhì)地柔軟，味道鮮美，營養(yǎng)豐富，同時(shí)具有很高的藥用價(jià)值，是世界公認(rèn)的高營養(yǎng)保健食品。我國木耳栽培規(guī)模逐年擴(kuò)大，木耳產(chǎn)業(yè)已經(jīng)成為東北部分地區(qū)的主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)，在農(nóng)業(yè)總產(chǎn)值中占有較大比重[2]。

近年來，隨著國家脫貧攻堅(jiān)戰(zhàn)略的實(shí)施，很多貧困地區(qū)將農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)出比較高的食用菌栽培項(xiàng)目作為脫貧的主要手段進(jìn)行推廣。棚室栽培黑木耳由于其具有占地面積小、資金投入少、商品產(chǎn)出比高等特點(diǎn)，已成為食用菌栽培項(xiàng)目中的主要品種。黑龍江省勃利縣境內(nèi)的多個(gè)黑木耳栽培項(xiàng)目紛紛上馬，項(xiàng)目實(shí)施過程中，由于栽培經(jīng)驗(yàn)不足，對栽培環(huán)境的控制不到位，會發(fā)生溫度過高、濕度過大和棚內(nèi)通風(fēng)不良等現(xiàn)象，為黑木耳病害的聚集和發(fā)生創(chuàng)造了條件。從黑龍江省勃利地區(qū)采集病原菌樣品，根據(jù)科赫法則的基本步驟進(jìn)行了一系列分離培養(yǎng)、病原菌回接和形態(tài)及分子生物學(xué)鑒定等試驗(yàn)，確定了該病原菌的分類地位，為后續(xù)防治奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病害調(diào)查與病原菌菌株獲取

采集具有典型病害特征的樣品進(jìn)行分離培養(yǎng)獲取純病原菌菌株。該病害的典型特征為：在菌袋內(nèi)和黑木耳子實(shí)體上形成白色的絲狀覆蓋物，初期極其薄弱，當(dāng)溫度和濕度增加后，白色的絲狀覆蓋物迅速增加，嚴(yán)重時(shí)可覆蓋整個(gè)黑木耳子實(shí)體表面，及時(shí)曬干黑木耳子實(shí)體，白色絲狀覆蓋物也不會消失，仍與黑木耳子實(shí)體緊密結(jié)合。當(dāng)這種病害發(fā)生以后，黑木耳子實(shí)體的色澤變黃，耳片邊薄，產(chǎn)量下降較為明顯(如圖1所示)。

在黑龍江省勃利縣五處黑木耳種植場采集具有明顯病癥的標(biāo)本6株，經(jīng)形態(tài)鑒定后均為未知病原菌(Unknown pathogen)。

1.2 實(shí)驗(yàn)室復(fù)制病害典型特征

根據(jù)科赫式法則，將分離出的病原菌與黑木耳進(jìn)行回接試驗(yàn)(試驗(yàn)所用木耳菌為 “黑威29”，由黑龍江省科學(xué)院微生物研究所提供)，定期觀察，記錄發(fā)病情況。經(jīng)過2周的培養(yǎng)后，黑木耳子實(shí)體上出現(xiàn)了與病原地所采集樣品同樣的發(fā)病特征。

1.3 培養(yǎng)基配方

第一，改良PDA培養(yǎng)基。配方為：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、磷酸二氫鉀3 g、硫酸鎂1.5 g、水1 000 mL。

圖1 病原菌附著在黑木耳菌袋和子實(shí)體上Fig.1 Pathogens attach to bags and fruiting bodies of Auricularia heimuer

第二，MEA培養(yǎng)基(上海古朵生物科技生產(chǎn))。

1.4 形態(tài)鑒定

用接種針將病原菌挑入盛有改良PDA培養(yǎng)基平板中央，置于25℃恒溫箱中培養(yǎng)，獲得純菌落。間隔24 h測量菌落直徑，觀察外觀形態(tài)變化及顏色等直至菌落長滿平板為止，記錄相關(guān)數(shù)據(jù)。用接種針挑取適量培養(yǎng)基、菌絲及其產(chǎn)物，置于載玻片的無菌水中，蓋好蓋玻片后直接在顯微鏡下觀察照相并測量。

1.5 菌絲體培養(yǎng)及DNA提取

將菌種活化后接種于液體PD培養(yǎng)基中，25℃淺層靜置培養(yǎng)3～5 d，收集菌絲，濾紙吸干后-20℃保存。采用CTAB 法提取DNA，DNA 提取物于-20℃冰箱貯藏備用。

1.6 ITS序列比對與分析

對未知病原菌unknown pathogen進(jìn)行ITS 序列的擴(kuò)增。引物為ITS1-F：5′- CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA -3′、ITS4-：5′- CAGGAGACTTGTACACGGTCCAG -3′。引物由大連寶生物有限公司合成。PCR反應(yīng)在Gene Amp PCR System 9700 PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，20 μL的反應(yīng)體系內(nèi)各種成分反應(yīng)體系見表1。擴(kuò)增程序見表 2。測序由上海生物工程有限公司完成。

表1 ITS序列擴(kuò)增反應(yīng)體系表Tab.1 ITS sequence amplification reaction system

表2 擴(kuò)增程序設(shè)置表Tab.2 Settings for amplification procedure

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

2.1.1 菌落形態(tài)

在MEA培養(yǎng)基上的菌落在7 d內(nèi)達(dá)到73～75 mm。氣生菌絲白色，致密，棉質(zhì)，表面白色，反面白色。

在PDA培養(yǎng)基上的菌落擴(kuò)散非?？欤? d內(nèi)達(dá)到82～84 mm。氣生菌絲白色，較為稀疏，絨毛狀，表面白色，3周后菌落表面呈現(xiàn)極淡紫色。

2.1.2 菌絲及孢子形態(tài)

在氣生菌絲體中產(chǎn)生的分生孢子，長度不定，分支分隔，每個(gè)芽枝都有一個(gè)分生孢子。分生孢子長見橢圓形到寬橢圓形，很少見亞球形，0-1分隔，10-18×7-10 μm。

該菌形態(tài)特征與已知真菌菌寄生(Hypomycesmycophilus)基本一致，初步確定該菌株為真菌菌寄生(Hypomycesmycophilus)。

2.2 序列分析

2.2.1 ITS擴(kuò)增結(jié)果及分析

測序結(jié)果顯示，供試菌株ITS 序列為499 bp，如下：

菌株的ITS 序列已提交GenBank，接受號為HM573930。

2.2.2 ITS序列系統(tǒng)發(fā)育分析

用已經(jīng)獲得的未知病原菌ITS序列在GenBank中比對，與相似度最高的7個(gè)不同種建立進(jìn)化樹，7種序列名稱及GenBank號見表3：

表3 相似度較高的7個(gè)種的ITS 序列名稱及號碼表Tab.3 ITS sequence name and number list of 7 species with high similarity

圖2 未知病原菌(unknown pathogen)與相似度 較高的7個(gè)品種的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic trees of unknown pathogens and seven species with high similarity

由圖2可知，各分枝內(nèi)菌株間的最大遺傳距離較大。其中病原菌(unknown fungi)與已知種HypomycesmycophilusGenBank編號KU937111.1的序列遺傳距離差異為0.0000，經(jīng)比對后其相似度為99%，結(jié)合宏觀經(jīng)典分類學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)一步確定該病原菌為真菌菌寄生(Hypomycesmycophilus)其生物學(xué)分類為：子囊菌門 (Ascomycota)、糞殼菌綱(Sordariomycetes)、肉座菌目(Hypocreales)、肉座菌科(Hypocreaceae)、菌寄生菌屬(Hypomyces)、真菌菌寄生(Mycophilus)。

3 討論

根據(jù)形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)方法鑒定，將病原菌確定為真菌菌寄生(Hypomycesmycophilus)。該真菌在我國最早的記錄是2017年，由中國科學(xué)院曾昭清[2-3]等發(fā)現(xiàn)的我國新紀(jì)錄種。菌寄生屬主要以寄生的方式生在其他真菌的子實(shí)體上，這也符合黑木耳栽培中真菌菌寄生以黑木耳子實(shí)體為寄主的實(shí)際情況，利用黑木耳子實(shí)體及其栽培環(huán)境為自身生長提供條件。在棚室栽培黑木耳的中期，比較容易遇到高溫天，在高溫、高濕且栽培大棚通風(fēng)較差的情況下，病原菌真菌菌寄生極易生長，造成病害的大規(guī)模發(fā)生。由于黑木耳本身的生長、生殖所需要的營養(yǎng)、溫度、濕度、pH、水分等基礎(chǔ)條件與真菌菌寄生所需條件有巨大的交集，因此對真菌菌寄生病害的防治造成較大困難，希望通過后續(xù)研究能夠找到應(yīng)對該病害的合理措施。