一種黑木耳棚室栽培病害病原菌鑒定

劉佳寧，馬銀鵬，張丕奇，馬慶芳

(黑龍江省科學院微生物研究所，哈爾濱 150010)

木耳(Auriculariaheimuer)[1]別名黑木耳、光木耳，其子實體膠質，色澤黑褐，質地柔軟，味道鮮美，營養豐富，同時具有很高的藥用價值，是世界公認的高營養保健食品。我國木耳栽培規模逐年擴大，木耳產業已經成為東北部分地區的主導產業，在農業總產值中占有較大比重[2]。

近年來，隨著國家脫貧攻堅戰略的實施，很多貧困地區將農產品產出比較高的食用菌栽培項目作為脫貧的主要手段進行推廣。棚室栽培黑木耳由于其具有占地面積小、資金投入少、商品產出比高等特點，已成為食用菌栽培項目中的主要品種。黑龍江省勃利縣境內的多個黑木耳栽培項目紛紛上馬，項目實施過程中，由于栽培經驗不足，對栽培環境的控制不到位，會發生溫度過高、濕度過大和棚內通風不良等現象，為黑木耳病害的聚集和發生創造了條件。從黑龍江省勃利地區采集病原菌樣品，根據科赫法則的基本步驟進行了一系列分離培養、病原菌回接和形態及分子生物學鑒定等試驗，確定了該病原菌的分類地位，為后續防治奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 病害調查與病原菌菌株獲取

采集具有典型病害特征的樣品進行分離培養獲取純病原菌菌株。該病害的典型特征為：在菌袋內和黑木耳子實體上形成白色的絲狀覆蓋物，初期極其薄弱，當溫度和濕度增加后，白色的絲狀覆蓋物迅速增加，嚴重時可覆蓋整個黑木耳子實體表面，及時曬干黑木耳子實體，白色絲狀覆蓋物也不會消失，仍與黑木耳子實體緊密結合。當這種病害發生以后，黑木耳子實體的色澤變黃，耳片邊薄，產量下降較為明顯(如圖1所示)。

在黑龍江省勃利縣五處黑木耳種植場采集具有明顯病癥的標本6株，經形態鑒定后均為未知病原菌(Unknown pathogen)。

1.2 實驗室復制病害典型特征

根據科赫式法則，將分離出的病原菌與黑木耳進行回接試驗(試驗所用木耳菌為 “黑威29”，由黑龍江省科學院微生物研究所提供)，定期觀察，記錄發病情況。經過2周的培養后，黑木耳子實體上出現了與病原地所采集樣品同樣的發病特征。

1.3 培養基配方

第一，改良PDA培養基。配方為：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、磷酸二氫鉀3 g、硫酸鎂1.5 g、水1 000 mL。

圖1 病原菌附著在黑木耳菌袋和子實體上Fig.1 Pathogens attach to bags and fruiting bodies of Auricularia heimuer

第二，MEA培養基(上海古朵生物科技生產)。

1.4 形態鑒定

用接種針將病原菌挑入盛有改良PDA培養基平板中央，置于25℃恒溫箱中培養，獲得純菌落。間隔24 h測量菌落直徑，觀察外觀形態變化及顏色等直至菌落長滿平板為止，記錄相關數據。用接種針挑取適量培養基、菌絲及其產物，置于載玻片的無菌水中，蓋好蓋玻片后直接在顯微鏡下觀察照相并測量。

1.5 菌絲體培養及DNA提取

將菌種活化后接種于液體PD培養基中，25℃淺層靜置培養3～5 d，收集菌絲，濾紙吸干后-20℃保存。采用CTAB 法提取DNA，DNA 提取物于-20℃冰箱貯藏備用。

1.6 ITS序列比對與分析

對未知病原菌unknown pathogen進行ITS 序列的擴增。引物為ITS1-F：5′- CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA -3′、ITS4-：5′- CAGGAGACTTGTACACGGTCCAG -3′。引物由大連寶生物有限公司合成。PCR反應在Gene Amp PCR System 9700 PCR儀上進行擴增，20 μL的反應體系內各種成分反應體系見表1。擴增程序見表 2。測序由上海生物工程有限公司完成。

表1 ITS序列擴增反應體系表Tab.1 ITS sequence amplification reaction system

表2 擴增程序設置表Tab.2 Settings for amplification procedure

2 結果與分析

2.1 形態學鑒定

2.1.1 菌落形態

在MEA培養基上的菌落在7 d內達到73～75 mm。氣生菌絲白色，致密，棉質，表面白色，反面白色。

在PDA培養基上的菌落擴散非常快，在7 d內達到82～84 mm。氣生菌絲白色，較為稀疏，絨毛狀，表面白色，3周后菌落表面呈現極淡紫色。

2.1.2 菌絲及孢子形態

在氣生菌絲體中產生的分生孢子，長度不定，分支分隔，每個芽枝都有一個分生孢子。分生孢子長見橢圓形到寬橢圓形，很少見亞球形，0-1分隔，10-18×7-10 μm。

該菌形態特征與已知真菌菌寄生(Hypomycesmycophilus)基本一致，初步確定該菌株為真菌菌寄生(Hypomycesmycophilus)。

2.2 序列分析

2.2.1 ITS擴增結果及分析

測序結果顯示，供試菌株ITS 序列為499 bp，如下：

菌株的ITS 序列已提交GenBank，接受號為HM573930。

2.2.2 ITS序列系統發育分析

用已經獲得的未知病原菌ITS序列在GenBank中比對，與相似度最高的7個不同種建立進化樹，7種序列名稱及GenBank號見表3：

表3 相似度較高的7個種的ITS 序列名稱及號碼表Tab.3 ITS sequence name and number list of 7 species with high similarity

圖2 未知病原菌(unknown pathogen)與相似度 較高的7個品種的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic trees of unknown pathogens and seven species with high similarity

由圖2可知，各分枝內菌株間的最大遺傳距離較大。其中病原菌(unknown fungi)與已知種HypomycesmycophilusGenBank編號KU937111.1的序列遺傳距離差異為0.0000，經比對后其相似度為99%，結合宏觀經典分類學數據進一步確定該病原菌為真菌菌寄生(Hypomycesmycophilus)其生物學分類為：子囊菌門 (Ascomycota)、糞殼菌綱(Sordariomycetes)、肉座菌目(Hypocreales)、肉座菌科(Hypocreaceae)、菌寄生菌屬(Hypomyces)、真菌菌寄生(Mycophilus)。

3 討論

根據形態學及分子生物學方法鑒定，將病原菌確定為真菌菌寄生(Hypomycesmycophilus)。該真菌在我國最早的記錄是2017年，由中國科學院曾昭清[2-3]等發現的我國新紀錄種。菌寄生屬主要以寄生的方式生在其他真菌的子實體上，這也符合黑木耳栽培中真菌菌寄生以黑木耳子實體為寄主的實際情況，利用黑木耳子實體及其栽培環境為自身生長提供條件。在棚室栽培黑木耳的中期，比較容易遇到高溫天，在高溫、高濕且栽培大棚通風較差的情況下，病原菌真菌菌寄生極易生長，造成病害的大規模發生。由于黑木耳本身的生長、生殖所需要的營養、溫度、濕度、pH、水分等基礎條件與真菌菌寄生所需條件有巨大的交集，因此對真菌菌寄生病害的防治造成較大困難，希望通過后續研究能夠找到應對該病害的合理措施。