基于網絡藥理學的金芪降糖片保護血管作用機制研究

蒙 濤，駱 璽，王 強

(中南民族大學 藥學院，湖北 武漢 430074)

糖尿病所致的血管內皮功能障礙引起的糖尿病血管并發癥是糖尿病患者致死、致殘的重要原因，尋找有效保護血管內皮細胞的藥物對防治糖尿病具有重要意義[1]。中醫經典方劑金芪降糖片由黃連、黃芪和金銀花3味中藥配伍而成，具有降血糖、保護血管和改善糖尿病血管并發癥的作用[2]。雖然金芪降糖片在糖尿病血管并發癥的治療方面頗有成效，但其成分復雜、活性多樣的特點，使其作用機制尚未闡明。

網絡藥理學融合了系統生物學、計算生物學等多學科的技術和內容，從整體和系統的角度去探索藥物與疾病間的關聯性，闡明藥物作用機制[3]，其系統性、整體性的特點與中醫中藥整體觀、辨證論治的原則不謀而合，目前己被廣泛應用到中醫藥研究領域[4-5]。本研究運用網絡藥理學方法，旨在探討金芪降糖片保護血管的作用機制。

1 材料與方法

1.1 黃芪降糖片有效成分的獲取

從TCMSP數據庫中獲得黃連、黃芪、金銀花已知的化學成分，以口服生物利用度(OB≥30%)、類藥性(DL≥0.18)和Caco-2滲透性(Caco-2≥0.40)為參數，篩選出活性較高的化合物[6]，獲取化合物PubChem CID，并從化合物的“Related targets”中獲得其對應的預測靶點，然后利用Uniprot數據庫對所得到的化合物預測靶點名稱進行矯正統一。

1.2 關鍵靶點篩選

將矯正后的化合物靶點基因名稱上傳到CTD(http：//ctdbase.org/)數據庫，利用其自身的Set Analyzer分析工具，設置P-value≤0.01，對靶基因進行疾病聚類(Enriched Diseases)，在結果中選擇Vascular Diseases，篩選出保護血管關鍵靶點。

1.3 疾病靶點GO注釋及通路分析

利用Cytoscape軟件的GlueGO工具，對篩選出的血管保護關鍵靶基因進行GO (gene ontology) 生物學過程富集分析和KEGG (KEGG pathway analysis)通路注釋分析，設定閾值P<0.05，選取具有顯著性差異的所有通路。

1.4 成分-靶點-通路網絡的構建

利用軟件 Cytoscape 3.6.1，根據上述收集到的化合物及其預測靶點、通路，構建“成分-靶點-通路”網絡圖。在網絡圖中，化合物、靶點、通路等信息用節點(Node)表示，化合物與其潛在作用靶點、靶點參與的疾病均以邊(edge)相連。以節點大小表示節點度(degree)，節點的度(degree)值越大，則這個點對應的成分、靶點或通路越有可能是作用機制中的關鍵點。

1.5 有效指數計算

以有效指數(Er)評價化合物對通路的作用效果，篩選出金芪降糖片保護血管的關鍵通路。

注：NT為該化合物作用的靶點總數，NTP為該化合物作用的靶點中參與該條通路的靶點數目，NP為該條通路的靶點總數。

1.6 整合通路構建

根據分子對接結果，將活性成分作用靶點的基因名稱導入KEGG數據庫，利用KEGG mapping工具，將靶點映射到對應通路獲取通路圖，得出金芪降糖片保護血管的關鍵作用機制。

1.7 活性成分與靶蛋白分子對接

利用Sybyl 1.0軟件對關鍵通路對應的成分靶點進行分子對接計算，以驗證關鍵靶蛋白與對應化合物的結合活性。在PDB (http：//www.rcsb.org/pdb/)蛋白數據庫中下載含有原配體的靶蛋白晶體結構及其配體結構。利用PubChem CID，在PubChem數據庫檢索并下載對應金芪降糖片活性化合物的3D結構(sdf格式)，之后利用ChemDraw 3D將sdf格式的化合物文件轉換為mol2格式文件。運用Sybyl軟件中的SurFlex-Dock模塊，選定靶蛋白中的原配體小分子藥物結合位點為活性中心，采用總分(Total Score)函數作為打分函數，進行對接計算。

2 結果

2.1 化學成分

從TCMSP 數據庫中分別獲得黃連、黃芪、金銀花目前已知成分48、87、236 種，具有較好口服生物利用度(OB≥30%)、類藥性(DL≥0.18)和Caco-2滲透性(Caco-2≥0.40)的化合物分別為黃連9種、黃芪12種、金銀花10種，其中24個化合物預測與115個靶點相關，見表1。

表1 金芪降糖片成分篩選結果

續表1

No.PubChemCIDMolecule NameOB (%)Caco-2DL相關靶點數來源M226436722phytofluene43.182.290.500金銀花M235280489beta-carotene37.182.250.5822金銀花M245281235kryptoxanthin47.251.690.570金銀花M256371716Ethyl linolenate46.101.540.202金銀花M265282184Mandenol42.001.460.193金銀花M275280794Stigmasterol43.831.440.7631金銀花M2811870462ZINC0397878143.831.320.760金銀花M29222284beta-sitosterol36.911.320.7538金銀花M305380108All-trans-Rhodoxanthin31.221.170.550金銀花M3110970376Corymbosin51.960.880.4126金銀花

2.2 CTD篩選及ClueGO分析結果

由CTD篩選出血管保護核心靶點49個，見表2。由ClueGO分析，49個核心靶點最相關的通路和生物過程(前15個)，見圖1。結果顯示，這些基因主要參與循環系統中的血管過程(Vascular process in circulatory system)、調節鈣離子轉運(Regulation of calcium ion transport)、調節血管直徑(Regulation of blood vessel diameter)等生物過程。在KEGG通路中，這些基因涉及糖尿病并發癥的AGE-RAGE信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、癌癥相關的蛋白聚糖(Proteoglycans in cancer)、流體剪切應力和動脈粥樣硬化(Fluid shear stress and atherosclerosis)等信號通路。

2.3 成分-靶點-通路網絡的構建

圖2為金芪降糖片成分-靶點-通路網絡，其中包含了66個節點和229條邊。66個節點中包括21個化合物，30個潛在靶點和15條通路。由網絡圖可知，化合物 M23、M29和M13具有較大節點度(degree)值，是金芪降糖片主要活性成分，PTGS2、NOS3和NOS2相鄰化合物節點最多，分別有多個活性化合物與之結合。

圖1 GlueGO分析結果

表2 CTD篩選結果

圖2 金芪降糖片成分-靶點-通路網絡

2.4 有效指數計算分析和通路圖獲取

活性化合物對相關通路的有效指數Er計算結果見圖3，計算值越大說明化合物對該通路作用越強。有效指數計算結果顯示，金芪降糖片活性化合物對VEGF信號通路作用最強，其中化合物M23對多條通路均有顯著作用。在KEGG數據庫，利用KEGG mapping工具，將參與VEGF信號通路的金芪降糖片活性化合物相關靶點映射到VEGF信號通路獲取通路圖，得到金芪降糖片保護血管核心作用機制，見圖4。

2.5 分子對接計算分析

以分子對接計算，驗證金芪降糖片活性化合物與VEGF信號通路相關靶蛋白的結合活性。根據有效指數Er計算結果，篩選出對VEGF信號通路活性最高的10個化合物，與對應的關鍵靶蛋白CASP9、MAPK14、NOS3、PTGS2進行分子對接，對接計算結果見表3。結果顯示，4個靶蛋白均有2個或2個以上的化合物對接打分接近或者超過原配體小分子，顯示金芪降糖片活性化合物對上述靶蛋白具有較好的結合活性。

圖3 有效指數計算結果

注：紅色為金芪降糖片活性化合物潛在作用靶點圖4 VEGF信號通路

表3 分子對接結果

3 討論

金芪降糖片對糖尿病所致的血管并發癥具有較為顯著的治療作用，針對中藥及其復方研究局限性的限制，本研究運用網絡藥理學方法分析金芪降糖片保護血管的分子機制。本研究收集到金芪降糖片24個活性化合物可能作用于115個靶蛋白，其中49個核心靶點(表2)涉及血管病變，這提示金芪降糖片活性化合物可能是通過作用于這49個核心靶點保護血管。通過ClueGO分析生物過程富集(圖1)發現，金芪降糖片保護血管的活性成分潛在作用靶點在循環系統中的血管過程、調節鈣離子轉運和調節血管直徑等生物過程富集，這些生物學過程紊亂很可能是病理性血管損傷的原因，同時表明金芪降糖片可能通過改善這些生物過程發揮其保護血管的作用。KEGG通路富集(圖1)以及“成分-靶點-通路”網絡(圖2)分析發現，金芪降糖片保護血管的活性成分潛在作用靶點參與糖尿病并發癥的AGE-RAGE信號通路、癌癥相關的蛋白聚糖、流體剪切應力和動脈粥樣硬化等信號通路，這些通路異常也是糖尿病血管病變的誘因，同時也有大量文獻證實金芪降糖片通過調控這些通路發揮其保護血管的作用。

高級糖基化終產物(AGEs)是誘導血管內皮細胞功能紊亂，引發糖尿病血管并發癥的重要原因。尹登科等[7]研究證實，黃連多糖能顯著減少高級糖基化終產物(AGEs)誘導下人臍靜脈內皮細胞高級糖基化終產物受體(RAGE)的表達，降低AGEs對內皮細胞的激活作用，進而改善AGEs誘導的內皮細胞損傷。血液流體剪切應力異常也是誘導內皮功能紊亂的重要因素。當歸補血湯由當歸和黃芪配伍而成，秦臻等[8]研究證實，增大當歸補血湯中黃芪的比例，可促進低血液流體剪切應力作用下受損內皮細胞的eNOS表達和NO分泌，進而顯著增強血管內皮保護效應。這些研究結果充分顯示出金芪降糖片調節AGE-RAGE信號通路，改善血液流體剪切應力異常，保護血管內皮細胞的作用，與本文網絡藥理學研究結果一致。

根據活性化合物對相關通路的有效指數Er計算結果(圖3)分析發現，金芪降糖片活性化合物對VEGF信號通路作用最強，其中涉及血管內皮生長因子(VEGF)、半胱氨酸蛋白酶9(CASP9)、絲裂原激活蛋白激酶14(MAPK14)、一氧化氮合酶(NOS3)、環氧合酶2(PTGS2)等5個靶點。根據VEGF信號通路圖(圖4)的信息以及查閱的相關文獻，發現參與VEGF信號通路的5個金芪降糖片活性化合物作用的靶點在糖尿病血管病變中發揮著重要作用。血管內皮生長因子(VEGF)能有效誘導血管再生，王興木等[9]研究發現，糖尿病視網膜病變患者血清中的血管內皮生長因子水平隨著病變的加重而顯著增加，這表明血管內皮生長因子在糖尿病視網膜病變的發生、發展中起著重要作用。此外，VEGF也能通過影響下游靶點，調節內皮細胞功能。Xu等[10]研究發現，VEGF過表達可影響PI-3K/AKT/m-TOR/eNOS和p38/MAPK信號，進而改善棕櫚酸誘導的糖尿病內皮細胞功能障礙。PI3K/AKT/mTOR磷酸化活化后，促進細胞周期，加速細胞增殖[11]。AKT磷酸化可促進eNOS磷酸化催化產生NO[12]，適量的NO 分泌可保護血管內皮功能，而過量的NO分泌則會引起內皮細胞通透性的改變，致使內皮細胞功能紊亂，引起血管內皮損傷[13]。P38/MAPK信號通路則通過調節膠原纖維蛋白原和纖溶酶原活性，誘導內皮細胞遷移和細胞骨架重組[14]。NO和PGI2是VEGF信號下游的分子，分別由eNOS和PTGS2催化產生，Fedorowicz等[15]研究證實，NO和PGI2依賴的機體功能受損是糖尿病主動脈內皮功能障礙的重要因素。這些研究結果提示金芪降糖片活性化合物可能通過作用于上述靶點，調節VEGF信號通路，進而保護血管，改善糖尿病血管并發癥。

現代藥理學研究指出，金芪降糖片活性化合物具有改善VEGF信號，進而保護血管的作用。鄭凝等[16]發現金芪降糖片具有抑制RAGE表達，降低腎組織VEGF、TGF-β1、CTGF 水平的作用。封芬等[17]研究發現，黃連素治療可促進糖尿病大鼠胸主動脈PI3K、Akt 和eNOS等蛋白表達，證實黃連素可能是通過激活PI3K/Akt/eNOS信號途徑，改善糖尿病血管內皮功能。本研究分子對接結果顯示(表3)，金芪降糖片活性化合物黃連素(M2)、表小檗堿(M5)、β-胡蘿卜素(M23)和十八碳二烯(M26)分別與2個或2個以上的靶蛋白對接打分接近或者超過原配體小分子，顯示出對VEGF信號通路靶蛋白具有較好的結合活性，這提示這4個化合物可能是金芪降糖片調節VEGF信號通路的主要活性化合物。其中，黃連素分子對接結果與文獻報道相符，進一步證實本研究結果的準確性。

本研究從網絡藥理學角度探討并揭示了金芪降糖片保護血管的主要成分、作用靶點和相關生物信號通路。網絡分析推測金芪降糖片活性化合物主要通過作用于VEGF、CASP9、MAPK14、NOS3、PTGS2等5個靶點，影響VEGF信號通路，從而起到保護血管的作用，其中發揮作用的關鍵活性化合物可能是黃連素、表小檗堿、β-胡蘿卜素和十八碳二烯。本研究為進一步深入探討金芪降糖片保護血管的作用機制提供借鑒。