不同品種牡丹ISSR 遺傳多樣性分析

李勇慧 于相麗 馬會萍 高凱 劉名雪

（1. 洛陽師范學院生命科學學院，洛陽 471934；2. 洛陽市農林科學院，洛陽 471023）

牡丹（Paeonia suffruticosa）是屬于芍藥科，芍藥屬，牡丹組的多年生落葉小灌木植物［1］。牡丹歷史悠久，牡丹可分為江南地區、中原地區、西南地區以及西北地區品種群。牡丹的觀賞價值非常高，其花朵艷麗多彩，并且在醫藥和飲食方面的價值也備受關注［2-3］。大多數牡丹種植區位于山東省荷澤市，河北省柏山市，陜西省漢中市，河南省洛陽市和四川省。據統計，我國牡丹的種植面積大約在 30 hm2［4］。

本研究對洛陽35 個品種的牡丹利用ISSR 進行分析。分子標記可以準確的反映出脫氧核糖核酸分子水平的遺傳變異，分子標記相對于生化標記、遺傳標記、細胞標記這些傳統的形態學標記來說有很多的優點，如標記的數目多，多態性高，分布廣泛，沒有環境限制等［5-6］。

簡單重復序列間隔區（Inter-simple sequence repeats，ISSR）技術是以SSR的3'或 5'端處連接上1-4 個嘌呤或者嘧啶堿基之后作為引物，然后對兩側具有反向排列的一段DNA 序列PCR 擴增，然后再通過電泳和染色后，根據是否有條帶來分析不同植物間ISSR 標記多態性［7-9］。AFLP 和SSR 技術是常見的牡丹遺傳多樣性分析技術，侯小改等［10］用 AFLP 技術研究了30 個來自不同地區的牡丹品種的遺傳差異。陳杰等［11］對皖北的30 個牡丹品種的利用SSR 技術分析其遺傳多樣性。也有利用ISSR 技術對四川地區、湖南地區、西南地區［12-14］的牡丹進行分析的報道，而未見對洛陽地區不同品種牡丹進行ISSR 遺傳多樣性分析的文章。因此，本文將利用ISSR 技術研究洛陽地區的35 種牡丹的遺傳多樣性，本文的目的在于為牡丹的合理利用以及牡丹資源管理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 本實驗所用的牡丹（表1）均選自洛陽牡丹研究院，選取有代表性的35 種牡丹品種進行實驗，根據研究需要于2018 年7-8 月進行采摘。之后將采摘的牡丹存放于裝有干燥硅膠的密封袋中備用。

1.1.2 試劑1mol/L 的Tris-HCl（pH8.0）溶液；氯仿；異戊醇；2% CTAB 溶液；3 mol/L 的NaAC 溶液；0.5 mol/L EDTA（pH8.0）溶液；冰酒精，β-羥基乙醇；75% 乙醇溶液；GoldViewI型核酸染色劑；1×TAE緩沖液；2×Taq MasterMix 混合液；10×DNA loading buffer。

1.1.3 主要儀器 SCIENTZ-48 型高通量組織研磨器；SEDIG 型梯度PCR 儀；JA2003A 型電子天平；K5500 Plus 型超微量分光光度計；LX-200 迷你離心機；TGL-16B 臺式離心機；Eppendorf AG 型PCR儀；THZ-82A 數顯恒溫振蕩器；DYY-8C 型電泳儀；101-1AB 型電熱鼓風干燥箱；ChampChemi 610 Plus型全自動多色熒光及化學發光凝膠成像系統。

表1 樣品及編號

1.2 方法

1.2.1 牡丹DNA 的提取 本實驗用改良的CTAB 法提取DNA。我們將每種牡丹提取兩組DNA 選取濃度和純度較好的進行實驗。

取少量牡丹葉片放于2 mL 印管，然后放入一顆鋼珠，再將此印管放進組織研磨機中，60s后取出，再加入1 000 μL 2%的CTAB 溶液和8 μL β-羥基乙醇；將印管放入水浴鍋中65℃水浴1 h，隔10 min 倒置一次達到混勻的目的；從水浴鍋中取出后，加入500 μL CI，搖床搖10 min；以12 000 r/min 的轉速常溫離心10 min 吸取上清液，于1.5 mL 離心管中；再加入500 μL CI 于1.5 mL 離心管中，搖床搖10 min；12 000 r/min 常溫離心10 min 吸取上清液約500 μL 于1.5 mL 離心管中；加入二倍體積的冰酒精和1/10 體積3 mol/L NaAC，低溫靜置一晚上（-18℃）；保留白色球狀物，倒去溶液；加600 μL 75%乙醇清洗兩次。

清洗后5-10 min 常溫干燥DNA，之后50℃烘干20 min 左右；加適量無菌水（50-100 μL）溶解DNA，置于冰箱中冷藏。之后通過超微量分光光度計測定DNA 的濃度與純度，過后將濃度與純度較好（濃度在50 ng/mL 左右）的DNA 放入冰箱備用。

1.2.2 引物篩選及ISSR-PCR 擴增 任意選取6 種牡丹品種的DNA 用UBC 公布的220 種引物進行篩選，進行初篩和復篩，使用溫度梯度模式選擇合適的退火溫度，溫度設定為45、50、55 和59℃四個溫度梯度，最后篩選出12 條能擴增出清晰條帶的引物，引物所用退火溫度分別為50℃和55℃（表2）。然后對牡丹樣品進行ISSR-PCR 擴增，PCR 采用的是15 μL 的體系，經過多次實驗后擴增體系選定的試劑是2×Taq MasterMix 混合液（表3）。經過反復試驗確定最佳PCR 擴增程序（表4）。

表2 引物序列

表3 PCR-ISSR 反應體系

表4 PCR 程序設置

1.2.3 瓊脂糖凝膠電泳 PCR 之后用電泳觀察結果，制備濃度為1%的膠。配膠之后，將膠在電泳液中放置之后拿出以防加樣孔中有氣泡影響加樣。第一個加樣孔加入4 μL D2000 Ladder 與1 μL Loadingbuffer混合 液（將Ladder 與Loadingbuffer 放在手套上吹打以混勻）作為對照組，之后的加樣孔加入5 μL 的擴增后的產物。電泳30-45 min（電壓為120-130 V，電流為100 mA），在電泳完成后利用凝膠成像系統觀察記錄結果，為后續實驗做準備。

1.2.4 數據處理 觀察電泳圖譜，將無條帶的位置記為0，有條帶記為1，在excel 表中列出0-1 矩陣。再利用POPGENE32 軟件進行遺傳分析，使用軟件計算多態位百分率、有效等位基因、Nei’s 基因多樣性、Shannon’s 信息指數等［15］。使用NTSYSpc-2.10e 得出UPGMA 親緣關系聚類圖，通過觀察聚類圖分析牡丹品種間的關系。

2 結果

2.1 ISSR擴增結果及多態性分析

篩選出的12 條引物擴增35 種牡丹皆能產生清晰的條帶（電泳結果圖見圖1-圖3）。結果擴增出的130 條條帶中多態性的條帶有125 條，多態性占比96.1%，除97、93、91、60 和48 號引物外，其余引物的多態性全部達到100%。其中97 號引物的多態性比率為90%是最低的。而125 號引物擴增出位點數最少（表5）。表明12 條引物的多態性良好，35 個牡丹品種的遺傳多樣性較豐富，利用ISSR 標記進行不同品種牡丹遺傳多樣性的分析是可行的。

2.2 遺傳多樣性分析

將0-1 矩陣從excel 表中導入到popgene32，對牡丹的多樣性進行統計和計算分析，結果平均Nei’s 基因遺傳多樣性指數（He）為0.294 5，最大值為0.4187最小值為0.090 1，平均Shannon 信息指（H）為0.465 9，最大值為0.6095最小值為0.190 4。從上述得到的數據分析后得出35 個牡丹品種遺傳多樣性豐富，12 條引物多態性良好。

2.3 牡丹的遺傳關系聚類分析

圖1 11 號引物的ISSR 擴增圖譜

圖2 45 號引物的ISSR 擴增圖譜

圖3 59 號引物的ISSR 擴增圖

表5 牡丹ISSR 標記的多態性Penoy

由12 條引物對洛陽35 個牡丹品種進行ISSRPCR 擴增獲得的130 個條帶，利用NTSYSpc-2.10e軟件計算洛陽35 個牡丹品種間的遺傳相似系數，遺傳相似系數范圍在0.553 8-1.0000 之間，其中遺傳相似系數最小的為香玉和王紅說明這兩個品種親緣關系較遠。遺傳相似系數最大的是瓔珞寶珠和香玉的表示這兩個品種親緣關系較近。再根據遺傳相似系數使用NTSYSpc-2.10e 軟件得到35 種牡丹的UPGMA親緣關系聚類圖（圖4）。遺傳相似系數以0.75為界，能夠將35 個牡丹品種分為5 類，第1 類包含5 個品種可分為2 個亞類，第1 亞類中包含3 個品種，依次為鶴頂紅、文培紫和海棠爭潤。第2 亞類包含2 個品種為似荷連和錦袍紅。第2 類包含1 個品種為銀粉金鱗。第3 類分為2 個亞類第1 亞類包括4 個品種依次為大正之夸、皺葉紅、迎日紅和圣代。第2 亞類包括金桂飄香、姚黃、朝陽紅、紅梅傲雪、綠蒂隱玉、紫蘭魁、瓔珞寶珠、香玉、紅寶石和太陽。第4 類分為2 個亞類，第1 亞類包括CH5、王紅、長枝英榮、映紅、萬花盛、玉樓點翠、大棕紫、景玉、花蝴蝶和蜂飛蝶舞。第2 亞類包括佛門袈裟、海黃、雪桂和白王獅子。第5 類的彩霞單獨為一亞類。

圖4 洛陽35 種牡丹的UPGMA 親緣關系聚類圖

3 討論

ISSR 可以提供更多的基因組DNA 信息是因為融合了SSR 和RAPD 的優點。因此，ISSR 在分子標記、基因定位、親緣關系分析、遺傳多樣性、輔助育種等方面已廣泛應用［16］。ISSR 標記技術對于牡丹來說具有很多優點，其中包括多態性豐富、實驗操作簡單、重復性強、試驗穩定性好［17-20］。因為ISSR分子標記技術優點眾多所以本實驗利用ISSR 對不同品種的牡丹進行遺傳多樣性研究。用NTSYSpc-2.10e軟件得出35 個牡丹樣品間的相似系數在0.5338-1.0000 之間，其中遺傳相似系數最小的為香玉和王紅說明這兩個品種的親緣關系較遠，遺傳相似系數最大是瓔珞寶珠和香玉的說明這兩個品種親緣關系較近。

圖5 聚類所得5 大類牡丹代表品種圖片

以遺傳相似系數0.75 為界，能夠將35 個牡丹品種分為5 類（代表品種如圖5），第1 類包含的5個品種分成了兩個亞類，第1 亞類中包含3 個品種，依次為鶴頂紅花為淺紅色、文培紫花為紫色、海棠爭潤花為粉紫紅色。第2 亞類包含2 個品種似荷連花色為粉紫色、錦袍紅花色為紫紅色。第2 類包含銀粉金鱗這一個品種花色深粉紅色。第3 類分為2個亞類第1 亞類包括4 個品種依次為大正之夸花為紫色、皺葉紅花為淺紅色、迎日紅花為紅色、圣代花為粉紅色。第2 亞類包括金桂飄香花為紫色、姚黃花為淡黃色、朝陽紅花為粉紅色、紅梅傲雪花為粉色、綠幕隱玉花色初開為綠色盛開后為白色、紫蘭魁花色為粉紫色、瓔珞寶珠花為淺紅色、香玉花初開淺粉色，盛開潔白如玉、紅寶石花為紫紅色、太陽花大紅色。第4 類分為兩個亞類，第1 亞類包括王紅花為紫紅色、CH5、長枝英榮、映紅花為紅色、萬花盛花為淺紅色、大棕紫花為紫紅色、玉樓點翠花為白色、景玉花為白色、花蝴蝶花為紅色、蜂飛蝶舞。第2 亞類包括海黃花為黃色、佛門袈裟花為紅色、白王獅子花為白色、雪桂花為白色。第5 類的彩霞單獨為一亞類，花色為淺紅色。由此可見，35 種牡丹并不一定按照花色進行分類，只有親緣關系較近時才會聚在一起。這一結果與安宗燕等［21］對紫斑牡丹品種的EST-SSR 遺傳多樣性分析的結果一致。也與陳向明等［22］用RAPD 技術對19 個日本牡丹品種進行親緣關系分析的結果一致。從研究后得出的結論和結果來看，ISSR 技術是研究牡丹品種分類的理想工具之一。

4 結論

由于牡丹非常名貴，牡丹的種質資源研究一直被人們所關注。因此牡丹的遺傳多樣性分析對于牡丹的種質資源管理是非常必要的。本研究采用改良的CTAB 法以及PCR 擴增從220 條引物中篩選出12 條引物，多態性條帶的占比為96.1%。用popgene32 分析得出35 種牡丹的平均Shannon 信息指數H=0.465 9，平均Nei's 基因多樣性指數He= 0.294 5，說明35 個牡丹品種遺傳多樣性豐富。利用NTSYS2.10e 分析最后將35 種牡丹分為5 類。實驗中的35 種牡丹并不一定按照花色進行分類，只有在親緣關系較近時才會聚在一起。