馬鈴薯StKUP12 的表達及參與鉀營養的功能研究

黃鳳君 李佳皓 劉瑞林 余麗萍 王西瑤 李立芹

（1. 四川農業大學農學院，成都 611130；2. 作物科學國家級實驗教學示范中心，成都 611130）

鉀素是植物生長所必須的營養元素之一，參與植物多種生理生化反應過程，與植物的生長發育緊密相關。馬鈴薯（Solanum tuberosumL.）作為我國第四大糧食作物，是典型的喜鉀植物，鉀素的吸收和利用與馬鈴薯的產量和質量直接相關［1］。植物對鉀的吸收和轉運主要依靠低親和性鉀離子通道和高親和性鉀離子轉運體。按照結構和功能，鉀離子通道蛋白分為：Shaker 家族通道、TPK 通道及Krilike 通道［2］。鉀離子通道AKT1 影響植物的生長發育，與植物的抗旱、耐鹽性及抗病性有關［3］。鉀轉運體分為：KUP/HAK/KT 轉運體、HKT/TrK 轉運體、CHX 轉運體及KEA 轉運體［4］，其中KUP/HAK/KT家族是一類H+/K+同向轉運的高親和鉀離子轉運體，能介導細胞內鉀的積累［4-5］。根據該家族基因的序列同源性分為：Cluster Ⅰ、Cluster Ⅱ、Cluster Ⅲ和 Cluster Ⅳ四個不同的亞家族，而 Cluster Ⅰ成員大部分屬于高親和性鉀轉運體；Cluster Ⅱ中的該家族多為低親和性鉀轉運體；Cluster Ⅲ和 Cluster Ⅳ成員多為高親和性鉀轉體［6］。KUP /HAK /KT 家族基因已在多種植物中被分離和克隆，擬南芥中鑒定出13 個［7］；水稻中27 個［8］；番茄中19 個［9］；桃中17 個［8］；木薯中21 個［10］。在擬南芥中，AtKUP1被證實介導根部細胞吸收外界K+，為雙親和性鉀離子轉運［11］；AtKUP7、AtKUP12為高親和鉀離子轉運體［12-13］。PpeKUP11和PpeKUP1基因分別在桃花開放和果實發育過程中主導 K+的吸收或轉運［14-15］；PpeKUP5主導桃樹根部 K+吸收的鉀轉運體［16］。

目前，該家族在馬鈴薯的研究報道相對較少，張子義等［17］的研究表明，鉀離子濃度為0.1 mmol/L、1.0 mmol/L 及10.0 mmol/L 時StKUP6和StKUP7表達存在不同程度的上調，1.00 mmol/L 時，StKUP6和StKUP7表達上調最明顯。本研究采用同源克隆的方法，從馬鈴薯品種費烏瑞它中克隆得到一個StKUP12基因，運用生物信息學對其結構、序列特征、進化規律等進行分析；利用qRT- PCR 技術對該基因的表達進行分析；最后利用鉀營養缺陷型酵母的功能互補，初步研究該基因的鉀吸收功能，旨為該基因在鉀營養方面的深入研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試馬鈴薯品種為費烏瑞它（Solanum tuberosumL. Favorita），組培苗由本實驗室提供。主要試劑包括：Vazyme Biotech 的感受態大腸桿菌DH5α、質粒小量抽提試劑盒、DNA 凝膠純化回收試劑盒、克隆載 體pMD19-T、10× Loading Buffer、Trizol、Gold View Ⅰ型核酸染色劑，其中2× Taq PCR Master Mix和cDNA 反轉錄試劑盒購自TaKaRa。酵母表達載體P416 和鉀吸收營養缺陷型酵母菌株R5421 由本實驗室提供，測序與引物合成由上海生工生物股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 非生物脅迫材料處理 供試馬鈴薯品種為費烏瑞它。將組培苗接種于MS 培養基，25℃恒溫光照培養室培養30 d，挑選長勢一致的組培苗，洗凈根部原有的MS 培養基，分別接種到低鉀（10 μmol/L K+）、高鹽（200 mmol/L NaCl）、脫落酸（1 μmol/L ABA）以及聚乙二醇（5% PEG-6000）培養基，放于25℃恒溫光照培養箱，分別在處理時間為0 h、3 h、6 h、12h和24h的時間點進行整株取樣，液氮速凍，放入-80℃冰箱中保存備用。

1.2.2StKUP12基因的克隆 馬鈴薯苗在25℃恒溫光照培養室培養60d后，選擇長勢較好的葉片進行取樣，液氮速凍，保存在-80℃備用。參考GenBank 收錄的馬鈴薯（Solanum tuberosumL.）StKUP12序列（XM_006340052.1.），采用同源克隆的方法，Premier5.0 軟件設計全長引物StKUP12-F 和StKUP12-R（表1，下劃線為BamHI和SalI酶切位點序列），擴增程序為：95℃預變性5 min；95℃變性30 s；55℃退火30 s；72℃延伸2 min 40 s；35 個循環。目的片段純化后與pMD19-T 載體16℃下連接過夜，轉入感受態大腸桿菌DH5α，隨后在含有氨芐青霉素（Ampicillin）的LB 固體平板上進行篩選，利用菌落PCR 檢測篩選出陽性克隆，送往上海生工生物股份有限公司進行測序。

1.2.3 StKUP12 生物信息學分析 采用ExPASy ProtParam tool分析StKUP12的理化性 質；ExPaSy-ProScale 分析該蛋白的親疏水性；NetPhos 3.1 Server分析蛋白磷酸化位點；利用NCBI 網站的CDD 程序分析蛋白的同源結構域；利用MEGA5.0 軟件，以鄰近分析法構建系統進化樹。

1.2.4StKUP12基因的表達分析 分別對馬鈴薯費烏瑞它塊莖的芽眼、愈傷15d的原種頂芽以及正常生長60d馬鈴薯植株的根、莖、葉進行取樣，在液氮中速凍后-80℃保存備用。利用Trizol 法提取總RNA，反轉錄cDNA 進行qRT- PCR。用Premier5.0設計Real-Time PCR 引物StKUP12-qF 和StKUP12-qR（表1），以馬鈴薯的EF1ɑL作為內參。反應體系為10 μL，反應程序為95℃反應30 s；95℃反應5 s；52℃反應30 s。所有的樣品均設置3 個生物學重復，相對表達量計算采用 2-ΔΔCt方法。

表1 引物名稱及序列

1.2.5StKUP12基因轉化酵母功能互補實驗 將克隆載體StKUP12-pMD19-T 與表達載體P416 進行BamHI和SalI雙酶切，連接轉化大腸桿菌DH5α感受態后，挑選單菌落進行菌落PCR 檢測法，篩選構建成功的陽性克隆，送往上海生工生物股份有限公司進行測序。將構建成功的酵母表達載體P416-StKUP12轉入鉀吸收缺陷型釀酒酵母菌株R5421，取200 μL 轉化混合物鋪于營養缺陷型平板，30℃培養3d后，用PCR 鑒定酵母的陽性克隆。挑選鑒定過的酵母單菌落在營養缺陷型平板上劃線，30℃培養3d后，用牙簽蘸取少量菌體進行擴大培養，調OD600為0.8，分別稀釋10 倍、100 倍和1 000 倍后，各取4 μL 于正常和鉀缺陷（2.25 mmol/L、0.12 mmol/L）的AP 培養基，3 次重復，28℃培養箱倒置培養2-3d后觀察酵母的生長情況。

2 結果

2.1 StKUP12基因的克隆

提取馬鈴薯葉片的R NA 進行反轉錄，以cDNA 為模板進行PCR 擴增，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，在2 000-3 000 bp 的位置上有清晰明亮的條帶（圖1）。將該條帶回收純化后與pMD19-T 載體連接，轉化感受態大腸桿菌DH5α，利用菌落PCR 鑒定陽性克隆，隨機挑選3 個陽性克隆送測序。結果顯示，3 個陽性克隆測序結果一致，目的片段長度為2547 bp。

2.2 StKUP12生物信息學分析

圖1 StKUP12 基因的克隆

2.2.1 StKUP12 的理化性質及親疏水性分析 理化性質分析結果表明，該基因編碼848 個氨基酸，其中亮氨酸Leu（97，1.4%）含量最高；其次為絲氨（76，9.0%），而色氨酸（11，3%）含量最少。帶正電荷氨基酸（Arg+Lys）74 個，帶負電荷氨基酸（Asp+Glu）77 個。StKUP12 蛋白的分子式為 C4294H6726N1080O1193S44，分子量大小為93.9 kD，理論等電點pI 為6.59，不穩定系數為39.57，脂肪系數為104.35，表明其屬于穩定的酸性蛋白。在親疏水性序列譜中，默認疏水氨基酸為較高的打分值（打分值＞0 代表疏水性，打分值＜0 代表親水性），結果顯示，該蛋白預測親水性的平均值（GRAVY）僅為0.329，存在14 個高打分峰值（scare＞2.0），最低值在第600-700 位氨基酸域；最高值在500-600 位氨基酸域（圖2），結合 GRAVY 值推測該蛋白為疏水性蛋白。

圖2 StKUP12 親疏水區預測

2.2.2 StKUP12 的磷酸化位點及同源結構域分析 磷酸化位點分析結果顯示，該蛋白磷酸化位點數量較多、分布廣。共包含49 個Ser 磷酸化位點、19個Thr 磷酸化位點和9 個Tyr 磷酸化位點（圖3-A）。結構域進行分析結果顯示，該蛋白的第103-676 位氨基酸序列區為K+轉運結構域，屬于K+轉運蛋白家族（圖3-B）。

圖3 StKUP12 的磷酸化位點及結構域預測

2.2.3 StKUP12 的氨基酸序列同源性分析 選擇20個不同物種的氨基酸序列構建系統進化樹。結果表明，該蛋白與潘那利番茄KUP12、番茄KUP12 具有較高的氨基酸序列同源性（98.00%、97.88%），與巴西橡膠樹KUP12 的同源性最低（77.74%）。另外，該蛋白與潘那利番茄、番茄、辣椒、煙草、美花煙草、芝麻、歐洲橄欖、胡蘿卜及咖啡樹的KUP12 蛋白在一個進化組（圖4）。

2.3 StKUP12的組織表達分析

采用qRT-PCR 反應分析該基因的組織表達情況，LSD法P＜0.05水平下進行顯著性檢驗。結果顯示，StKUP12基因在根、莖、葉、頂芽和芽眼均有表達，表達量在莖、葉和頂芽3 個組織中較高；其次是芽眼，分別是根的1.75、2.08、2.50 和1.63 倍（圖5）。

2.4 StKUP12的非生物脅迫表達分析

采用qRT-PCR 反應分析該基因在4 種脅迫處理下的表達情況，在LSD 法P＜0.05 水平下進行顯著性檢驗。結果表明，低鉀脅迫處理后該基因表達量明顯上調，24h內呈先上升后下降的趨勢，在脅迫12h后表達量達到最大且為對照組的32.86 倍（圖6-A）。ABA 脅迫處理后該基因表達量先顯著上調后受到抑制，在脅迫3h后表達量達到最大且為對照組的2.49倍，隨后表達量明顯下降（圖6-B）。高鹽脅迫處理后該基因表達量受到抑制，在脅迫6h后表達量最低且為對照組的0.36 倍（圖6-C）。PEG 脅迫處理后該基因表達量上調，24h內呈先上升后下降的趨勢，在脅迫處理6h后表達量最大且為對照組的2.62 倍（圖6-D）。

2.5 StKUP12參與鉀營養的功能研究

取轉化成功的酵母，振蕩培養16h后，轉移到低鉀和正常的AP 培養基進行培養觀察，結果表明，在正常的AP 培養基上，表達StKUP12 和AtAKT1的酵母在4 種稀釋濃度下均正常生長，而轉P416 的酵母在100、1 000 倍稀釋濃度生長緩慢；在鉀缺陷的AP 培養基上，表達 AtAKT1 和StKUP12 的酵母均能正常生長，而轉P416 酵母不能生長。結果表明，StKUP12 轉運體能恢復鉀吸收營養缺陷型酵母在低鉀條件下的K+吸收功能，在酵母中具有吸收外界 K+的能力（圖7）。

圖4 StKUP12 進化樹分析

圖5 StKUP12 在不同組織中的相對表達量分析

3 討論

圖6 StKUP12 在非生物脅迫條件下的表達模式分析

圖7 酵母功能互補實驗

生物信息學分析結果預測StKUP12編碼蛋白為一個穩定的酸性疏水蛋白，具有多個絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸激酶磷酸化位點，韓敏等［12］對AtKUP7蛋白3 個磷酸化位點的研究發現，蛋白質磷酸化位點對該基因的鉀轉運活性發揮著一定的作用，說明StKUP12蛋白具有磷酸化位點，能被激酶磷酸化，從而參與生理過程的調控。該基因編碼蛋白的第103-676 位氨基酸序列屬于K+轉運蛋白家族結構域，表明StKUP12 蛋白可能參與鉀離子的轉運。

已有報道表明，AtKUP12在嫩葉中表達量較 高［13］，AtKUP4在植物根中的表達較強［18］，NsHAK11在各組織器官中均有表達，在主根中的表達量最高［19］。本實驗結果表明，StKUP12基因在組織中均有明顯的表達，其中在莖、葉、頂芽表達較高，與AtKUP12的表達一致［13］。StKUP12基因的表達受到低鉀脅迫的誘導，處理12h時表達量達到對照組的32.86 倍，與AtKUP3、AtHAK5等受低鉀誘導表達情況一致［20-21］，推測該基因參與馬鈴薯低鉀脅迫的響應。該基因的表達在ABA 脅迫下先顯著誘導后受到抑制，而宋志忠等［16］的實驗表明PpeKUP5在ABA 脅迫下表達上調，推測是由于兩個研究所用的ABA 處理濃度不同。HAK/KUP/KT 家族在鹽脅迫下受到 Ca2+信號、轉錄水平、轉錄因子及相關激素（如乙烯、ABA 和生長素）等的調控［22］，StKUP12基因在鹽脅迫下表達受到抑制，而AtKUP2、AtKUP3及AtKUP6的表達受鹽脅迫的誘導［23］，可能是由于基因和材料的差異造成。干旱是影響植物生長和發育的一個重要因素，該基因的表達在PEG 脅迫下受到誘導，與獐茅的AlHAK1基因響應干旱脅迫的結果一致［24］，推測該基因參與馬鈴薯對干旱脅迫的響應。

利用酵母功能互補試驗，韓敏等［12］證明了AtKUP7具有鉀離子轉運活性，楊天元等［25］發現OsHAK5表現為高親和鉀轉運特性。本實驗結果表明，在正常的AP 培養基中3 種酵母可以正常生長；在鉀缺陷的AP 培養基中轉StKUP12和陽性對照的酵母可以正常生長，而陰性對照的酵母不能正常生長，表明StKUP12 在酵母中具有轉運外界K+的功能，與韓敏［12］的實驗結果一致。后續可通過構建過表達或CRISPR 基因編輯載體轉化馬鈴薯，獲得轉基因材料，進一步明確該基因在鉀營養方面的功能。

4 結論

本研究利用同源克隆的方法獲得了StKUP12，生物信息學分析預測該基因編碼一種穩定的酸性疏水蛋白，該蛋白存在鉀離子轉運結構域，屬于鉀離子轉運體。表達分析結果說明，StKUP12在組織中均有明顯的表達，表達量在莖、葉、頂芽3 個組織中較高；其次是芽眼，最后是根。其表達量受低鉀、高鹽、ABA 和PEG 的調控，其中在低鉀和PEG 脅迫下表達受到誘導，在高鹽和ABA 脅迫下表達受到抑制。酵母功能互補實驗表明，該轉運體能恢復鉀吸收缺陷型酵母在低鉀培養基上生長的能力。