N-乙酰半胱氨酸對非酒精性脂肪性肝炎模型小鼠肝細胞線粒體自噬的影響

張寧萍 方穎 劉雪靜 謝黎 吳健 沈錫中

非酒精性脂肪性肝炎(NASH)發病率日益升高，但其發病機制尚未明確。NASH的肝細胞以線粒體異常為特征，線粒體損傷是促進單純性脂肪肝向NASH進展的重要因素之一[1- 2]。正常生理條件下，受損線粒體可以通過自噬機制(即線粒體自噬)被及時清除[3]。肝細胞自噬缺陷與脂肪滴堆積、胰島素抵抗、NLRP3炎癥小體活化有關[4]。N-乙酰半胱氨酸(NAC)是還原型谷胱甘肽的前體，有保護肝細胞作用，用于藥物性肝損傷的治療[5]。研究者的前期研究提示，NAC能改善游離脂肪酸誘導的大鼠原代肝細胞線粒體自噬功能缺陷[6]，但其體內作用尚不明確。本研究通過建立高脂高糖誘導的NASH小鼠模型，以NAC進行干預，觀察NAC對NASH小鼠肝細胞線粒體自噬的影響。

材料與方法

一、實驗動物

清潔級C57BL/J6小鼠18只，6～8周齡，雄性，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供。飼養于復旦大學上海醫學院實驗動物中心。

二、主要試劑與儀器

主要儀器：熒光分光光度計(Nanodrop)，PCR儀(BIO-RAD)，電泳儀(BIO-RAD)，全自動化學發光圖像分析系統(Tanon)，Real-Time定量PCR儀(Thermo)，快速型血糖儀(羅氏公司)，單電子激光共聚焦顯微鏡(Leica)，倒置顯微鏡(Nikon)，熒光顯微鏡(Nikon)。主要試劑：甘油三酯檢測試劑盒(南京建成生物研究所)，Masson染色試劑盒(武漢谷歌生物科技有限公司)，抗體：β-actin(Santa Cruz)，COX IV(Abcam)，LC3B(Novus)，Parkin(Proteintech)，PINK1(Santa Cruz)，P62(Proteintech)。

三、動物分組與模型建立

小鼠分別于耳緣打孔編號，在適應性喂養1周后隨機分為3組：正常飲食對照組，高脂高糖誘導NASH組(HFCD)，高脂高糖喂養同時添加NAC干預實驗組(HFCD+NAC)，每組6只。高脂高糖誘導NASH給藥方法參見本課題組研究論文[7]，HFCD+NAC組在高脂高糖喂養同時按照每日150 mg/kg經飲用水給予NAC干預。NAC配制方法：1L飲用水(高糖水)中加入0.45 g NAC，調整pH值為7.0。分別于喂養16周后對3組小鼠實施安樂死，并保留肝臟和外周血液標本。

四、測定指標及方法

(一)肝臟指數及組織病理學檢查 新鮮肝組織完整分離后稱重，計算肝臟指數=肝臟濕重/體重×100%。福爾馬林固定肝組織后石蠟包埋切片，HE染色及Masson染色后光鏡下觀察肝臟變化。

(二)血清生化指標檢測 小鼠眼眶取血，3 000 rpm離心10 min后分離血清，由全自動生化儀檢測血清ALT、AST、IL-1β。空腹血糖通過取小鼠尾靜脈血由羅氏快速血糖儀檢測。

(三)肝組織甘油三酯定量檢測 采用南京建成生物研究所甘油三酯(TG)檢測試劑盒(A110-2)檢測。過程按照說明書進行。

(四)組織免疫熒光染色 肝組織冰凍切片用預冷丙酮固定10 min，PBS 洗滌3次。3% BSA室溫封閉30 min。擦干封閉液后加一抗(COX IV標記線粒體，LC3B標記自噬)，平放于濕盒內4℃過夜。第二天PBS 洗滌3次。加二抗后避光室溫孵育1小時。PBS 洗滌3次。加DAPI染液，避光室溫孵育10 min。PBS 洗滌3次。蓋玻片封片后在單電子激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

(五)RT-PCR檢測 提取肝臟總RNA后經熒光分光光度計檢測RNA定量。取2 μg總RNA為模板，配置20 μL反應體系，按試劑盒說明進行逆轉錄。RT-PCR每個目的基因或內參均配制3管。反應體系為：SYBR green MIX 10 μL，目的基因/內參正引物 1.0 μL，目的基因/內參正引物 1.0 μL，cDNA 2.0 μL，ddH2O 6.0 μL。PCR反應條件：95℃ ×10 min，循環45次，95℃ ×15秒，60℃ ×1 min，繪制熔解曲線。結果用目的基因與內參基因的相對表達量表示，計算方法采用ΔΔCT法。

(六)Western blot檢測 肝組織勻漿后，12 000 g離心5 min，收集上清得到總蛋白溶液。經15%-8%濃度的SDS-PAGE凝膠電泳分離后，轉移到PVDF膜。將PVDF膜放入5%的脫脂牛奶-TBST封閉1 小時。分別4 ℃孵育Parkin、PINK1、LC3B、P62、β-actin一抗過夜。TBST洗滌后，二抗室溫孵育30 min，TBST 洗滌3次。將ECL發光液加在PVDF膜的蛋白面上反應1-2 min，吸除多余發光液后放入全自動化學發光圖像分析系統拍照。

五、統計分析

近似正態分布的計量資料采用均數±標準差表示，計數資料采用n(%)進行統計描述。多組間計量資料的比較采用ANOVA進行檢驗，組間多重比較采用LSD法進行檢驗。計數資料比較采用χ2檢驗或Fisher精確卡方檢驗。統計分析應用SPSS 18.0或Graphpad 6.0軟件，P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、 NAC對NASH小鼠肝臟的影響

對照組小鼠肝臟外形正常，呈鮮紅色，質地柔軟。HFCD組(圖1B)肝臟逐漸增大，呈黃白色，表面可見顆粒樣改變。HFCD+NAC組(圖1C)肝臟大體組織形態變化較HFCD組(圖1A)輕。HE染色對照組肝細胞形態正常，肝小葉內結構完整，肝索排列整齊有序，肝細胞未見變性、壞死或炎性細胞浸潤。HFCD組肝細胞逐漸出現小泡型及大泡小泡混合型的脂肪沉積及部分壞死，且范圍由散在加重至廣泛。匯管區周圍炎癥細胞浸潤，炎性細胞浸潤以大量單個核細胞為主，細胞核被脂滴擠壓到細胞邊緣(圖1E)。HFCD+NAC組肝細胞炎癥及脂肪沉積情況較HFCD組輕(圖1F)。Masson染色，HFCD組及HFCD+NAC組肝組織纖維化較對照組顯著，但相對于HFCD組，HFCD+NAC組肝組織纖維化無明顯減輕(圖1G-I)。

圖1 對照組、HFCD、HFCD+NAC組小鼠肝臟大體

與對照組相比，HFCD組及HFCD+NAC組小鼠體質量及肝重增加，空腹血糖、肝臟甘油三酯及血清ALT、AST、白細胞介素1-β(IL-1β)升高，其中HFCD+NAC組較HFCD組肝臟甘油三酯及血清ALT、AST、IL-1β降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

二、 NAC對NASH小鼠肝細胞線粒體自噬的影響

小鼠肝組織冰凍切片以COX IV和LC3B雙重染色分別標記線粒體和自噬小體，在共聚焦纖維鏡下觀察比較3組小鼠肝組織內線粒體自噬的水平可見：對照組小鼠肝組織中的線粒體(COX IV)呈點狀均勻分布，HFCD組肝組織內COX IV表達量下降，且為團塊狀聚集，提示線粒體損傷逐漸加重。同時，HFCD組LC3B表達也明顯降低。相對于HFCD組，HFCD+NAC組COX IV和LC3B表達量升高，提示線粒體自噬較HFCD組活躍。見圖2A。

RT-PCR法檢測小鼠肝臟線粒體自噬相關基因Atg5、Atg7、Parkin/PARK2、PINK1表達量，HFCD組及HFCD+NAC組均較對照組下降，但相對于HFCD組，HFCD+NAC組的線粒體自噬相關基因在mRNA水平上升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2D。

蛋白印跡法檢測各組小鼠肝組織內Parkin、PINK1的蛋白表達及自噬水平變化。結果顯示，HFCD組小鼠較對照組肝組織內Parkin、PINK1表達降低，同時LC3B II/I比值降低，P62表達量增高。提示HFCD組小鼠肝細胞線粒體自噬水平降低。HFCD+NAC組較HFCD組線粒體自噬水平升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2B-C。

討 論

還原型谷胱甘肽是存在于肝臟中的抗氧化分子，能通過抗自由基作用抑制線粒體通透性改變、調控凋亡。NAC是谷胱甘肽的前體，具有抗氧化劑作用和血管舒張作用，可以減輕組織缺氧，在臨床中常用于藥物性肝損傷、急性肝衰竭等肝病的治療[5, 8-9]。

表1 對照組和實驗組小鼠一般情況、血生化指標比較(±s)

A.小鼠肝組織冰凍切片免疫熒光雙染色。B.小鼠肝細胞線粒體自噬相關蛋白Western blot顯影結果。C.Western blot相對灰度比。D.小鼠肝細胞線粒體自噬相關基因Atg5、Atg7、Parkin/PARK2、PINK1的mRNA相對表達量。

圖2NAC對NASH小鼠肝細胞線粒體自噬的影響

線粒體異常是NASH患者肝細胞病變的特征之一[10-13]。線粒體對氧化應激損傷十分敏感。NASH進程中高游離脂肪酸造成的脂毒性導致肝細胞損害，刺激生成過量ROS，無法清除時蓄積的ROS會攻擊線粒體造成線粒體腫脹，線粒體內呼吸鏈復合體酶活性下降，引起線粒體途徑的內源性ROS(mtROS)生成增多及ATP合成減少，導致線粒體損傷和功能障礙。外源性ROS和mtROS還可以直接造成線粒體DNA(mtDNA)斷裂和損傷[13-14]。通常受損傷的線粒體通過線粒體自噬途徑被清除，并減少線粒體途徑的內源性ROS生成，保護線粒體功能穩定，確保應激的細胞存活[3, 15]。線粒體自噬下降，細胞防衛功能缺失，過量的mtROS累積攻擊線粒體造成線粒體膜破裂，使線粒體向胞質內釋放細胞色素C凋亡誘導因子等凋亡相關蛋白，從而誘導細胞凋亡以及導致細胞死亡[4]。

我們前期研究證實，NASH小鼠肝細胞線粒體自噬水平下降誘導NLRP3炎癥小體活化，是導致NASH肝細胞炎癥進展的因素之一。同時，體外細胞實驗提示，NAC可以通過抑制細胞ROS和mtROS形成，部分恢復線粒體自噬水平，從而抑制NLRP3炎癥小體活化[6]。本研究通過NASH模型小鼠進一步證實，添加NAC減輕了高脂高糖誘導的NASH小鼠肝臟細胞脂肪沉積和炎癥。相對于HFCD組，HCFD+NAC組小鼠肝細胞受損的線粒體自噬水平升高，且部分線粒體功能恢復。提示NAC可能通過改善肝細胞線粒體自噬，進而減輕肝細胞炎癥進展。