TLR4/PI3K信號(hào)通路對(duì)脂多糖誘導(dǎo)人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞縫隙連接蛋白43 mRNA表達(dá)的影響

李明遠(yuǎn)，巫相宏，閉 奇，文偉明，鄭鵬飛，吳 成，竇 慧，陳基源

（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣西 南寧 530021）

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是威脅人類健康的多種心血管疾病共同的病理生理基礎(chǔ)，其特點(diǎn)是以內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙和炎癥因子等不斷在動(dòng)脈壁造成損傷的慢性炎癥反應(yīng)。人的心臟組織中存在TLR4受體，TLR4受體激活使胞外信號(hào)得以轉(zhuǎn)導(dǎo)到胞內(nèi)，TLR4受體與機(jī)體應(yīng)激、炎癥、損傷、壞死密切相關(guān)[1]KLA是脂多糖（LPS）的主要活性部位，是一種強(qiáng)烈的炎癥啟動(dòng)因子，可通過TLR4受體導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生。PI3K信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞生存、增殖、分化、凋亡的功能起到非常重要的調(diào)控作用[2]。Cx43是介導(dǎo)細(xì)胞間小分子物質(zhì)和信號(hào)的傳遞的主要蛋白，Cx43對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的正常生理功能有重要調(diào)控作用。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)旨在觀察PI3K特異性抑制劑LY294002對(duì)KLA刺激的HCAEC 中TLR4、PI3K及CX43 mRNA表達(dá)量的影響，探討LY294002對(duì)冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞縫隙連接蛋白功能的影響及其可能的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑及材料

HCAEC細(xì)胞株、內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基（ECM）購自美國Sciencell公司，KLA購自美國Avanti Polar Lipids公司，LY294002購自美國CST公司， RNA提取試劑盒購自日本TAKARA公司，引物由上海生工生物股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將HCAEC種植于含4mLECM完全培養(yǎng)基的25 cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2，新植入的冠脈內(nèi)皮細(xì)胞隔天換液，視生長情況以后48～72 h換液，待培養(yǎng)瓶中細(xì)胞生長至90%密度左右即可傳代。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組

將HCAEC分為以下4組：空白對(duì)照組（Con組）、KLA組（0.01 mg/L）、LY組（2.5 μM）、LY+KLA組（LY2.5μM+KLA0.01 mg/L）。

1.3 RT-PCR法檢測(cè)

采用PCR法檢測(cè)各組HCAEC中TLR4、PI3K、Cx43的mRNA表達(dá)水平，應(yīng)用ABI Prism 7500序列檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行PCR反應(yīng)。以各組GADPH擴(kuò)增產(chǎn)物為內(nèi)參照，用2△△CT法計(jì)算各組TLR4、PI3K、Cx43 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間的比較采用單因素方差分析，其中兩組間的比較采用SNK檢驗(yàn)，當(dāng)P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

RT-PCR法檢測(cè)各組冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中TLR4、PI3K、Cx43的mRNA相對(duì)表達(dá)量：結(jié)果顯示，與Con組比較，KLA組TLR4、PI3k、Cx43 的mRNA表達(dá)量顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），LY組PI3K表達(dá)量顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與KLA組比較，KLA+LY組TLR4、PI3k、Cx43 的mRNA表達(dá)量顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）,見表1。

表1 各組HCAEC中TLR4、PI3K、Cx43的mRNA相對(duì)表達(dá)水平（±s）

表1 各組HCAEC中TLR4、PI3K、Cx43的mRNA相對(duì)表達(dá)水平（±s）

注：與空白對(duì)照組相比，*P＜0.05；與KLA組相比，#P＜0.05

組別 TLR4 mRNA PI3K mRNA Cx43 mRNA空白對(duì)照組 1.00±0.11 1.00±0.06 1.00±0.02 KLA組 2.95±0.28* 2.15±0.32* 2.56±0.10*LY組 0.74±0.11 0.54±0.11* 0.88±0.14 LY+KLA組 2.04±0.14# 0.68±0.20# 1.35±0.28#

3 討 論

動(dòng)脈粥樣硬化的形成與血管內(nèi)皮損傷、平滑肌遷移、脂質(zhì)浸潤及血管持續(xù)性的慢性臨床炎癥反應(yīng)息息相關(guān)[3]，抗炎的失衡可能是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生與進(jìn)展的關(guān)鍵所在。TLR4信號(hào)通路通過多個(gè)途徑參與動(dòng)脈粥樣硬化的起始和進(jìn)展及一系列AS相關(guān)的細(xì)胞因子、炎癥因子的合成與釋放等環(huán)節(jié)[4]。PI3K通過影響血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞等進(jìn)而影響動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。在炎癥反應(yīng)的進(jìn)程中，PI3K信號(hào)通路的激活可使細(xì)胞產(chǎn)生大量的炎性因子[2]。Kang Q等[5]的研究發(fā)現(xiàn)抑制PI3K、AKT、TNF-a的mRNA表達(dá)對(duì)高脂飲食喂養(yǎng)的ApoE基因敲除的小鼠具有抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。Cx43在細(xì)胞膜形成縫隙連接起到細(xì)胞間的通訊作用。在開放狀態(tài)下,炎癥因子可從縫隙連接中通過使CX蛋白羧基端磷酸化，蛋白構(gòu)象發(fā)揮變化，進(jìn)而調(diào)節(jié)縫隙連接的功能。CHEN等[6]發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化的冠心病患者Cx43和Cx46的表達(dá)顯著上調(diào)，細(xì)胞縫隙連接功能紊亂可能是動(dòng)脈粥樣硬化性疾病發(fā)病的原因之一。

本研究采用KLA誘導(dǎo)人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞炎性損傷構(gòu)建內(nèi)皮早期動(dòng)脈硬化模型，采用PI3K特異性阻滯劑LY進(jìn)行干預(yù)。本研究從細(xì)胞水平證實(shí)KLA可能通過激活TLR4/PI3K信號(hào)傳導(dǎo)通路及其下游信號(hào)傳導(dǎo)，上調(diào)TLR4、PI3K、Cx43蛋白和mRNA表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)促炎細(xì)胞因子表達(dá)，參與AS的炎癥反應(yīng)。使用PI3K信號(hào)通路特異抑制劑LY294002可以下調(diào)KLA誘導(dǎo)的TLR4、PI3K、cx43蛋白和mRNA的表達(dá)，進(jìn)而減少AS炎癥反應(yīng)形成。為控制AS炎癥反應(yīng)提供更充足的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。我們的這些發(fā)現(xiàn)也許能夠冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的基礎(chǔ)研究和臨床治療提供新的思路。