兩色金雞菊黃酮成分對高糖高脂誘導的細胞模型能量代謝紊亂的影響

阿米拉?阿不拉提，范雪梅，毛新民，姚藍

兩色金雞菊黃酮成分對高糖高脂誘導的細胞模型能量代謝紊亂的影響

阿米拉?阿不拉提1，范雪梅2，毛新民1，姚藍1

1.新疆醫科大學中醫學院，新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆醫科大學藥學院，新疆 烏魯木齊 830011

觀察兩色金雞菊黃酮成分對高糖高脂誘導大鼠腎小球系膜細胞HBZY-1能量代謝紊亂的影響，探討其保護作用機制。采用高糖高脂誘導HBZY-1細胞建立體外糖尿病腎病代謝紊亂細胞模型，將HBZY-1細胞分為正常組、模型組和兩色金雞菊黃酮成分不同劑量組。采用MTS實驗檢測模型細胞增殖水平，倒置顯微鏡觀察模型細胞形態變化，細胞劃痕實驗觀察模型細胞細胞外基質分泌，Western blot檢測細胞能量代謝調控因子5'腺苷-磷酸活化蛋白激酶α（p-AMPKα）、乙酰輔酶a羧化酶1（ACC1）、甾醇調節元件結合蛋白1（SREBP1）及氧化應激因子一氧化氮合酶（eNOS）、尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4（NOX4）的蛋白表達。兩色金雞菊黃酮成分能抑制高糖高脂誘導的HBZY-1細胞增殖，細胞間隙增大、密度顯著降低；兩色金雞菊黃酮成分促進模型細胞p-AMPKα、p-ACC1、eNOS的蛋白表達，抑制模型細胞SREBP1、NOX4、ACC1的蛋白表達；劃痕實驗結果顯示，兩色金雞菊黃酮成分對模型細胞細胞外基質分泌有顯著抑制作用，同時α-平滑肌肌動蛋白的蛋白表達顯著降低。兩色金雞菊黃酮成分可能通過調控AMPK/SREBP1/ACC1能量代謝通路，抑制模型細胞增殖、氧化應激，進而改善腎臟纖維化病變。

兩色金雞菊；黃酮成分；氧化應激損傷；糖脂代謝；細胞模型

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病最嚴重的微血管并發癥，是慢性腎功能衰竭發病的主要原因。據統計，臨床約70%糖尿病患者同時并發慢性腎臟疾病[1]。糖尿病發病過程中伴隨的能量代謝紊亂可能與DN密切相關[2]。能量代謝紊亂通過激活細胞中多種信號通路誘發腎臟氧化應激反應，使腎臟功能性細胞大量纖維化因子致細胞外基質（ECM）聚集、基底膜增厚，誘發腎臟功能異常與纖維化病變[2-3]。然而能量代謝紊亂與DN確切的作用機制迄今尚不清楚。兩色金雞菊Nutt.為新疆地產藥用植物資源，具有活血化瘀、清熱解毒功效。化學成分研究發現，兩色金雞菊含有豐富的黃酮類化合物，具有多種生物學活性[4]。課題組前期研究發現，兩色金雞菊黃酮成分和兩色金雞菊提取物具有較好的降糖、降脂和抗氧化應激作用，同時能活化腎臟能量代謝因子5'腺苷-磷酸活化蛋白激酶（p-AMPK）[5-7]。兩色金雞菊黃酮成分是否通過調控能量代謝紊亂發揮保護腎臟作用尚不清楚。本研究擬采用高糖高脂誘導大鼠腎小球系膜細胞HBZY-1建立體外DN能量代謝紊亂模型，觀察兩色金雞菊黃酮成分通過調控能量代謝通路改善DN可能的作用機制。

1 實驗材料

1.1 藥物及細胞株

兩色金雞菊黃酮提取物，新疆醫科大學協同創新實驗室提供。HBZY-1細胞，購自上海中喬新舟生物科技有限公司，貨號ZQ0540；根據說明書要求，將HBZY-1細胞傳代于含10%胎牛血清、1%雙抗DMEM培養液，置于含5%CO2、37 ℃恒溫培養箱中培養。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM培養基（HyClone company，批號SH30022.01），p-AMPK α（Affinity Biosciences，AF3423）、一氧化氮合酶（eNOS，Cell Signaling，貨號32027）、尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4（NOX4，Proteintech，貨號14247-1-AP）、乙酰輔酶a羧化酶1（ACC1，Proteintech，貨號21923-1-AP），磷酸化乙酰輔酶A羧化酶（p-ACC1，Affinity，貨號AF3421）、甾醇調節元件結合蛋白1（SREBPl，貨號sc-13551）、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）抗體（Cell Signaling，貨號19245S），彩色蛋白Marker（Thermo Scientific Pierce，貨號26116、26625），蛋白上樣緩沖液（北京太陽生物科技有限公司，貨號P1016），Novex AP chromogenic substrate（Invitrogen，貨號WP20001），MTS細胞增殖試劑盒（Promega公司，貨號G3580）。Steri-Cult型CO2培養箱（美國Thermo公司），GelDocXR＋凝膠＋分析系統、156-8001型垂直電泳槽（美國Bio-Rad公司），ZESSAxioObserverZ1倒置顯微鏡（德國ZEISS公司），5427R型高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司），Multiskan GO酶標儀（美國Thermo Fisher公司）。

2 實驗方法

2.1 兩色金雞菊黃酮成分溶液制備

精密稱取兩色金雞菊黃酮提取物凍干粉20 mg，置于1.5 mL EP管，加入二甲基亞砜（DMSO）0.4 mL，反復震蕩使粉末充分溶解，得濃度為50 mg/mL兩色金雞菊黃酮提取物溶液，根據預實驗結果設置給藥濃度，加入不同體積DMSO稀釋成相應的細胞給藥濃度。

2.2 高糖高脂溶液配制

分別稱取D-葡萄糖（HG）和棕櫚酸（PA）適量，將HG充分溶解于DMEM培養基中，定容于10 mL容量瓶，PA用DMSO震蕩充分溶解，制成HG、PA濃度分別為1 moL/L和0.25 mol/L貯備液，經0.22 μm微孔濾膜過濾備用。本實驗采用HG 100 mmol/L、PA 250 μmol/L干預細胞建立DN模型。

2.3 細胞分組及干預

MTS實驗分組：用DMEM完全培養基培養HBZY-1細胞，將培養瓶中覆蓋率達80%～90%細胞離心收集，對細胞混懸液進行計數。接種于96孔板，每個濃度設4個復孔，4×103個/孔。5 h后待細胞貼壁生長，棄上清液并用含或不含藥物的無血清DMEM培養基干預。將細胞分為10組：正常組（NC組，有細胞但不干預），高糖高脂組（HG＋PA組），兩色金雞菊黃酮不同劑量（1、5、10、20、40、80、160、320 μg/mL）組（HG＋PA＋FC組）。

Western blot和細胞劃痕實驗分組：取3×105個/孔細胞混懸液，按每孔2 mL接種于6孔板中培養，5 h待細胞貼壁生長后，PBS清洗細胞2次，將細胞設置為NC組、HG＋PA組、HG＋PA＋FC 25 μg/mL組、HG＋PA＋FC 50 μg/mL組、HG＋PA＋FC 100 μg/mL組、HG＋PA＋FC 150 μg/mL組，每個濃度設3復孔，干預給藥24 h后，棄上清液，用于各項指標檢測。

2.4 MTS實驗

按照“2.3”項下實驗分組處理細胞，給藥干預細胞，繼續培養24、48、72 h后，棄上清液，加入MTS溶液20 μL/孔，37 ℃恒溫培養箱避光孵育2 h，于酶標儀波長490 nm處測定吸光度（OD值），實驗重復3次，計算細胞增殖率。細胞增殖率（%）＝實驗組OD值÷對照組OD值×100%。倒置顯微鏡觀察細胞形態。

2.5 細胞劃痕實驗

在6孔板背后用滅菌直尺均勻畫出平行3條橫線。每孔加入約5×105個細胞，待細胞鋪滿6孔板后，用10 μL槍頭垂直于背后的橫線劃痕，用PBS清洗2次，將脫落細胞碎片洗凈，按照“2.3”項下實驗分組干預。分別在干預0、12、24 h時間點同一位置拍照比較各組劃痕寬度，從而反映細胞平面遷移能力。

2.6 Western blot實驗

按照“2.3”項下實驗分組對干預后的細胞提取總蛋白，加細胞裂解液（RIPA∶PMSF＝1∶1），置于冰上裂解，離心分離上清液，采用BCA法對蛋白濃度定量，蛋白變性后分裝于EP管中，保存備用；蛋白上樣每孔30 μg總蛋白，電泳（80 V分離膠，100 V濃縮膠）至溴酚藍完全跑出，采用濕轉法恒壓100 V冰浴轉膜，將蛋白移至PVDF膜上；5%脫脂奶粉封閉膜2 h；4 ℃搖床孵育一抗過夜，避光常溫孵育二抗（1∶2000）2 h，顯色劑顯色后，凝膠成像儀拍照，測灰度值，實驗獨立重復3次。Image Lab軟件進行條帶灰度值分析。以GAPDH、β-actin為內參，計算蛋白相對表達量。

3 統計學方法

4 結果

4.1 兩色金雞菊黃酮成分對高糖高脂誘導的HBZY-1細胞增殖的影響

高糖高脂干預細胞模型4、48、72 h，細胞增殖率分別為130.21%、129.6%、120.94%，且明顯高于NC組，差異有統計學意義（＜0.01）。隨兩色金雞菊黃酮成分濃度增加及作用時間延長，抑制細胞增殖24 h時達高峰。其中在24、48 h兩色金雞菊黃酮成分（20、40、80 μg/mL）細胞增殖率明顯降低，差異有統計學意義（＜0.01）。當兩色金雞菊黃酮成分濃度達160 μg/mL時，細胞增殖抑制作用均減弱，其原因可能是隨兩色金雞菊黃酮成分濃度增加及作用時間延長，其藥物本身顏色加深，OD值也隨之升高。結果見圖1。

4.2 兩色金雞菊黃酮成分對高糖高脂誘導的HBZY-1細胞形態的影響

不同濃度兩色金雞菊黃酮成分干預HBZY-1細胞24 h后，與NC組比較，高糖高脂環境可促進HBZY-1細胞增殖，并可見部分HBZY-1細胞形態明顯改變，細胞出現肥大、聚集和呈現長梭形的現象，而隨兩色金雞菊黃酮成分濃度升高，細胞增殖受到抑制，相鄰細胞間隙增大。結果見圖2。

注：A. NC組；B. HG＋PA組；C～J. HG＋PA＋FC（1、5、10、20、40、80、160、320 μg/mL）組；與A比較，##P＜0.01；與B比較，*P＜0.05，**P＜0.01

注：A. NC組；B. HG＋PA組；C～J. HG＋PA＋FC（1、5、10、20、40、80、160、320 μg/mL）組

4.3 兩色金雞菊黃酮成分對高糖高脂誘導的HBZY-1細胞能量代謝因子調控的影響

4.3.1 5'腺苷-磷酸活化蛋白激酶α蛋白表達

p-AMPKα在高糖高脂干預細胞后，與NC組比較顯著降低其表達，差異有統計學意義（＜0.01），兩色金雞菊黃酮成分干預后各劑量組均不同程度上調p-AMPKα的表達，但兩色金雞菊黃酮成分25、50、100 μg/mL組與HG＋PA組比較差異無統計學意義，僅兩色金雞菊黃酮成分150 μg/mL干預細胞后，顯著上調p-AMPKα表達，差異有統計學意義（＜0.05）。結果見圖3。

注：A. NC組；B. HG＋PA組；C～F. HG＋PA＋FC（25、50 100、150 μg/mL）組；與A比較，#P＜0.05；與B比較，*P＜0.05

4.3.2 甾醇調節元件結合蛋白1蛋白表達

高糖高脂誘導細胞后，與NC組比較，SREBP1表達上調，差異有統計學意義（＜0.01）；兩色金雞菊黃酮成分干預后各劑量組均能明顯抑制細胞SREBP1表達，差異有統計學意義（＜0.01）。結果見圖4。

4.3.3 磷酸化乙酰輔酶a羧化酶1蛋白表達

高糖高脂誘導細胞后，與NC組比較，p-ACC1表達降低，但差異無統計學意義。兩色金雞菊黃酮成分干預后各劑量組均不同程度上調p-ACC1的表達，與HG＋PA組比較，差異有統計學意義（＜0.05），在兩色金雞菊黃酮成分 50 μg/mL時顯著上調p-ACC1的表達，差異有統計學意義（＜0.01）。結果見圖5。

注：A. NC組；B. HG+PA組；C～F. HG＋PA＋FC（25、50 100、150 μg/mL）組；與A比較，##P＜0.01；與B比較，**P＜0.01

注：A. NC組；B. HG＋PA組；C～F. HG＋PA＋FC（25、50 100、150 μg/mL）組；與B比較，*P＜0.05，**P＜0.01

4.4 兩色金雞菊黃酮成分對高糖高脂誘導的HBZY-1細胞氧化應激因子表達的影響

4.4.1 一氧化氮合酶蛋白表達

高糖高脂誘導下，細胞中氧化應激保護因子eNOS表達與NC組比較顯著降低（＜0.05）；兩色金雞菊黃酮成分干預細胞后，eNOS表達明顯降低，與HG＋PA組比較，兩色金雞菊黃酮成分25、50、100 μg/mL時均能顯著上調細胞eNOS的表達（＜0.01），而兩色金雞菊黃酮成分 150 μg/mL對eNOS的上調作用差異無統計學意義。見圖6。

注：A. NC組；B. HG＋PA組；C～F. HG＋PA＋FC（25、50 100、150 μg/mL）組；與B比較，**P＜0.01

4.4.2 尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4蛋白表達

高糖高脂誘導細胞后，NOX4表達升高，差異無統計學意義。兩色金雞菊黃酮成分干預細胞后，兩色金雞菊黃酮成分各劑量組均能抑制細胞NOX4表達，與HG＋PA組比較，兩色金雞菊黃酮成分25 μg/mL時無明顯差異；兩色金雞菊黃酮成分100、150 μg/mL時明顯抑制細胞NOX4的表達（＜0.01）。結果見圖7。

注：A. NC組；B. HG+PA組；C～Ｆ. HG＋PA＋FC（25、50 100、150 μg/mL）組；與B比較，**P＜0.01

4.5 兩色金雞菊黃酮成分對高糖高脂誘導HBZY-1細胞纖維化的影響

4.5.1 細胞黏附能力

不同濃度兩色金雞菊黃酮成分處理后，動態觀察0、12、24 h兩色金雞菊黃酮成分各劑量組細胞間隙大小及劃痕間距變化；隨著時間推移，NC組細胞間隙與劃痕間距變化不明顯，HG＋PA組細胞間隙與劃痕間距隨培養時間的增加而顯著變小，細胞密度明顯增加，不同濃度兩色金雞菊黃酮成分干預細胞后，隨培養時間的延長，細胞間隙與劃痕間距逐漸變大，細胞密度明顯降低。見圖8。

注：A. NC組；B. HG＋PA組；C～F. HG＋PA＋FC（25、50 100、150 μg/mL）組

4.5.2 α-平滑肌肌動蛋白表達

NC組細胞α-SMA表達與HG＋PA組比較無明顯差異，兩色金雞菊黃酮成分干預細胞后，α-SMA表達均不同程度上有所降低，其中兩色金雞菊黃酮成分25、50 μg/mL時較HG＋PA組α-SMA表達降低，但差異無統計學意義；兩色金雞菊黃酮成分100、150 μg/mL時能顯著抑制高糖高脂誘導HBZY-1細胞α-SMA的表達，差異有統計學意義（＜0.01），其中兩色金雞菊黃酮成分150 μg/mL作用最顯著。見圖9。

注：A. NC組；B. HG＋PA組；C～F. HG＋PA＋FC（25、50 100、150 μg/mL）組；與B比較，**P＜0.01

5 討論

DN并非由單一因素引發，而是由多因素、多途徑導致的疾病。臨床發現，降血糖劑、腎素醛固酮系統拮抗劑的應用并未能很好地防治DN發生。除遺傳因素外，機體長期代謝紊亂是造成DN的累積誘發因素，而糖代謝與脂代謝異常則起決定性作用。本實驗采用葡萄糖與棕櫚酸干預HBZY-1細胞建立DN糖脂代謝異常的細胞模型，探討兩色金雞菊黃酮成分通過對模型細胞能量代謝的調控改善DN作用機制。

AMPK在腎臟中高表達，在細胞缺乏能量狀態下被活化，是糖尿病患者糖脂質代謝調控的關鍵因子[8]。SREBP1、ACC1均為調節脂肪酸表達、參與脂肪酸合成的關鍵調控因子[9]。AMPK不僅通過調節AMP/ATP 比值調控機體血糖穩態，同時磷酸化的AMPK通過抑制下游SREBP1、ACC1的表達，下調三酰甘油、脂肪酸等脂質的生成和積累[10]。可見AMPK與DN腎臟糖脂代謝調控密切相關，本研究發現，兩色金雞菊黃酮成分能顯著活化模型細胞中AMPK，抑制SREBP1、p-ACC1的表達，對DN腎臟能量代謝紊亂有改善作用。

NOXs是細胞中一類具有氧化活性的蛋白。在機體代謝紊亂情況下，eNOS解偶聯，可使NOX表達增多，產生大量活性氧（ROS），誘導細胞或組織氧化應激損傷。腎臟是氧化應激反應最為敏感的器官之一[11]。NOX4廣泛分布在腎臟血管、系膜細胞、腎小管、足細胞中。臨床研究發現，NOX4在DN患者體內被持續激活，誘導產生大量ROS產物，與腎臟生理功能異常和病理結構的改變密切相關[12]。兩色金雞菊黃酮成分干預模型細胞后，可顯著下調細胞NOX4的表達，說明兩色金雞菊黃酮成分具有抑制HBZY-1細胞氧化應激反應的作用。但也發現，HG＋PA組細胞與NC組比較NOX4表達有所升高，差異無統計學意義，推測可能由于不同種屬細胞對高糖高脂刺激反應有所差異，大鼠腎小球系膜細胞NOX4表達對高糖高脂刺激反應敏感性較低。與此同時，模型細胞eNOS表達顯著下調，說明細胞已受到毒性損傷，兩色金雞菊黃酮成分干預能顯著升高eNOS水平。結合上述結果，我們推測兩色金雞菊黃酮成分可能通過調控能量代謝穩態，逆轉細胞中氧化應激導致的細胞毒性和功能損傷。然而HBZY-1細胞氧化應激損傷與ECM聚集、纖維化因子釋放密切相關。腎臟不同功能細胞在氧化應激狀態下，分泌腎組織纖維化因子α-SMA，轉化為肌組織成纖維細胞，導致腎臟細胞ECM聚集、基底膜增厚、不同程度的纖維化。我們通過劃痕實驗進一步發現兩色金雞菊黃酮成分能顯著抑制細胞中ECM分泌，同時下調α-SMA的表達。因此，兩色金雞菊黃酮成分可能通過調控能量代謝AMPK/SREBP1/ACC1通路，抑制細胞中氧化應激所導致的ECM分泌與α-SMA表達異常，對腎臟纖維化病變發揮保護作用。但能量代謝紊亂發生機制較復雜，兩色金雞菊黃酮成分調控能量代謝對腎臟的作用機制也較復雜，仍有待進一步研究。

[1] HU C, SUN L, XIAO L, et al. Insights into the mechanisms involved in the expression and regulation of extracellular matrix proteins in diabetic nephropathy[J]. Current Medicinal Chemistry,2015, 22(24)：1-21.

[2] SU W, CAO R, HE Y C, et al. Crosstalk of hyperglycemia and dyslipidemia in diabetic kidney disease[J]. Kidney Dis (Basel), 2017,3(4)：171-180.

[3] BREYER M D, NOVEL K M. Avenues for drug discovery in diabetic kidney disease[J]. Expert Opin Drug Discov,2018,13(1)：65-74.

[4] 毛新民,盧偉,李琳琳,等.兩色金雞菊化學成分和藥理作用研究進展[J].藥物應用與監測,2014,11(4)：235-240.

[5] 姚藍,蔣潔,王靖宣,等.兩色金雞菊對糖尿病大鼠腎臟纖維化RhoA/ ROCK/NOX4信號通路的影響[J].中國中醫藥信息雜志,2019,26(1)：57-62.

[6] YAO L, MAO X M, LI L L, et al. The anti-inflammatory and antifibrotic effects ofNutt. on high-glucose-fat diet and streptozotocin-induced diabetic renal damage in rats[J]. BMC Complementary and Alternative Medicine, 2015,15：314-326.

[7] 顏仁梁.兩色金雞菊黃酮類化學成分研究[J].中草藥,2018,49(21)：5046-5050.

[8] RAJANI R, PASTOR-SOLER N M, HALLOWS K R. Role of AMP-activated protein kinase in kidney tubular transport, metabolism, and disease[J]. Current Opinion in Nephrology and Hypertension, 2017,26(5)：1-9.

[9] VAN KRIEKEN R, MARWAY M, PARTHASARATHY P, et al. Inhibition of SREBP with fatostatin does not attenuate early diabetic nephropathy in male mice[J]. Endocrinology,2018,159(3)：1479-1495.

[10] LI Y, XU S Q, MIHAYLOVA M M, et al. AMPK phosphorylates and inhibits SREBP activity to attenuate hepatic steatosis and atherosclerosis in diet-induced insulin-resistant mice[J]. Cell Metabolism,2011,13(4)：376-388.

[11] SEDEEK M, MONTEZANO A C, HEBERT R L, et al. Oxidative stress, NOX isoforms and complications of diabetes-potential targets for novel therapies[J]. J Cardiovasc Transl Res,2012,5(4)：509-518.

[12] BABELOVA A, AVANIADI D, JUNG O, et al. Role of NOX4 is murine models of kidney disease[J]. Free Radic Biol Med,2012,53(4)：842-853.

Effects of Flavonoids ofNutt. on Energy Metabolism Disorder of High Glucose and High Fat-induced Cell Model

AMILA Abulati1, FAN Xuemei2, MAO Xinmin1, YAO Lan1

To observe the effects of flavonoids ofNutt. on energy metabolism disorder of high glucose and high fat-induced cell model; To explore its protective mechanism.Rat diabetic nephropathy metabolic disorder cell model was established by high glucose and high fat-induced HBZY-1 cell. HBZY-1 cells were divided into normal group, model group and flavonoids ofNutt. different dosage groups. MTS assay was used to detect the cell proliferation level of the model cells, and the morphology of the cells was observed under an inverted microscope. Cell scratch assay was used to observe the secretion of extracellular matrix in model cells. Western blot was used to detect the protein expressions of cellular energy metabolism regulator factor p-AMPKα, ACC1, SREBP1 and oxidative stress factor eNOS, and NOX4.Flavonoids ofNutt. could inhibit cell proliferation of high glucose and high fat-induced HBZY-1 cells. Bigger cell space and lower cell density were detected after Flavonoids of Coreopsis Tinctoria Nutt treatment; FC could increase the expressions of p-AMPKα, p-ACC1, and eNOS and inhibit the expressions of SREBP1, NOX4, ACC1, and α-SMA; Cell scratch assay results showed that flavonoids ofNutt. significantly inhibited ECM excretion, and α-SMA protein expression decreased.Flavonoids ofNutt. can inhibit cell proliferation and oxidative stress via regulating AMPK/SREBP1/ACC1 signaling pathway then improve the renal fibrosis.

flavonoids ofNutt.; flavonoids; oxidative stress damage; glycolipid; cell model

R285.5

A

1005-5304(2020)05-0035-07

10.3969/j.issn.1005-5304.201908139

國家自然科學基金（81560671）

姚藍，E-mail：56174475@qq.com

（2019-08-09）

（2019-09-15；編輯：華強）