基于響應面法的華金6號金銀花葉總黃酮有效部位的制備及其體外抗氧化活性研究

姜 珊，張康華，孫 平，代 龍，張 芳，高 鵬

（山東中醫(yī)藥大學 藥學院，山東濟南 250300）

金銀花為忍冬 （Lonicera japonica Thunb.）的干燥花蕾或帶初開的花，主要含有木犀草苷等黃酮類成分、綠原酸等酚酸類成分和以馬錢苷為代表的環(huán)烯醚萜苷類成分（劉嬋娟等，2010）。研究表明金銀花具有抗病原微生物、抗氧化、抗病毒等藥理作用（劉敬盛，2016；潘秋文，2004），尤其是在抑菌、抗氧化領域，其活性甚至比花高（楊海霞等，2013）。因此，金銀花葉可應用于飼料抑菌添加劑和食品抗氧化劑等方面。華金6號金銀花是山東中醫(yī)藥大學經過10余年培育出的金銀花新品種（王玲娜等，2017、2016）。該品種金銀花葉資源豐富，成本較低，可作為飼料添加劑，具有很高的開發(fā)價值。

近年來，從天然植物中尋找自由基消除劑是現(xiàn)代食品和藥品行業(yè)的發(fā)展趨勢。通過化學方法合成的抗氧化劑毒性較大，風險較高，常會引起嚴重的不良反應。以中草藥及其有效成分進行抗氧化研究，已成為近年研究的熱點，其中黃酮類成分被認為抗氧化效果較理想。研究表明，金銀花葉總黃酮粗提物具有良好的抗氧化活性 （鄭必勝等，2013；武雪芬等，1999），但是對于金銀花葉總黃酮純化物的抗氧化活性研究較少。為了得到純度較高的金銀花葉總黃酮有效部位，本試驗采用D101型大孔吸附樹脂對金銀花葉總黃酮進行純化工藝優(yōu)選，為今后金銀花葉總黃酮類成分抗氧化活性研究奠定基礎。

1 試驗材料

1.1 金銀花葉 金銀花葉（2018年6月采集于山東中醫(yī)藥大學藥用植物園，樣品經鑒定為華金六號金銀花）置于室內通風干燥處，自然陰干后粉碎，備用。

1.2 藥品與試劑 D101、HPD-100、S-8、NKA-9型大孔吸附樹脂 （滄州寶恩吸附材料科技有限公司）；蘆丁對照品（純度≥98%，上海源葉生物）；DPPH、ABTS（上海麥克林公司）；乙醇（天津市四通化工廠）；維生素 C（Vc）（購自國藥集團）；其他試劑均為國產分析純。

1.3 儀器 高速粉碎機 （上海兆申科技有限公司，XS-02）；電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司，AL-204）；移液槍（Dragon-Lab）；紫外-可見光光度儀（上海儀電分析儀器廠，L3S）；超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，KQ-250）；旋轉蒸發(fā)器（上海申順生物科技有限公司）；恒溫振蕩儀（金壇市宏華儀器廠，SHA-CA型）；電熱鼓風干燥箱（林茂科技，101型）。

2 試驗方法

2.1 金銀花葉總黃酮的提取及含量測定

2.1.1 金銀花葉總黃酮的含量測定 根據(jù)崔鵬等（2018）方法，采用紫外分光光度法，繪制蘆丁對照品（0.1995 mg/mL）標準曲線，以吸光度為縱坐標，蘆丁標準品濃度為橫坐標得回歸方程A=11.95C+0.0059，r=0.9994，線性范圍 0~0.2 mg/mL。

供試品含量測定：取供試品溶液1 mL于25 mL容量瓶中加 5%的 NaNO2溶液 1 mL，10%的 Al（NO3）3溶液1 mL，搖勻，靜置5 min后加4%的NaOH溶液10 mL，蒸餾水定容至刻度，搖勻后靜置15 min，于510 nm處測吸光度，從回歸方程中計算總黃酮的濃度。

2.1.2 金銀花葉總黃酮的提取 根據(jù)李志明（2006）方法，設計 L9（34)正交試驗，料液比 1：25、超聲時間50 min、乙醇體積分數(shù)60%、超聲溫度30℃時黃酮提取率最高。即金銀花葉經干燥粉碎后，精密稱取約1 g粉末（過三號篩），于索氏提取器中回流至石油醚無色，將處理后的金銀花粉末置于具塞錐形瓶中精密加入25倍量60%乙醇，超聲處理 （功率500 W，頻率40 kHz)50 min，用60%的乙醇補足減失的重量，放冷至室溫，抽濾，抽濾液減壓濃縮回收乙醇，濃縮液置100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，測定含量。

2.2 金銀花葉總黃酮的分離純化

2.2.1 大孔樹脂預處理 將 D101、HPD-100、HPD-300、NKA-9型大孔吸附樹脂95%醇洗、3%酸洗、3%堿洗后用去離子水洗至中性后，70℃烘干備用。

2.2.2 樹脂篩選 根據(jù)姚佳等（2018）的方法，分別稱取上述預處理好的四種大孔吸附樹脂各1 g于100 mL錐形瓶中，分別加入金銀花葉總黃酮提取液25 mL（1.53 mg/mL），置于振蕩儀中吸附12 h后測定上層液中總黃酮濃度。將上述吸附飽和的樹脂加入25 mL 60%乙醇振蕩解吸12 h，過濾并檢測濾液中黃酮濃度。相關參數(shù)計算公式如下：

靜態(tài)吸附量/（mg/g）＝V藥液×（C0－C1）/m；

靜態(tài)解吸量/（mg/g）＝V洗脫液×C2/m；

靜態(tài)解吸率/%＝靜態(tài)解析量/靜態(tài)吸附量×100；

式中：C0為黃酮初始濃度，mg/mL；C1為黃酮剩余濃度，mg/mL；C2為洗脫液中黃酮濃度，mg/mL；m 為樹脂質量，g。

2.2.3 樹脂純化工藝 D101型大孔吸附樹脂純化工藝的優(yōu)選參考馬翠霞等（2018）方法。

2.2.3.1 泄露曲線測定 取30 mL D101型大孔吸附樹脂，裝柱，取“2.1.2”提取液 （1.53 mg/mL)15 mL上樣，上樣流速為1 mL/min，收集流出液，每15 mL收集1份，共上樣90 mL。按“2.1.1”方法測定總黃酮含量，并以上樣液體積為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制泄露曲線。

2.2.3.2 上樣流速的選擇 稱取4份預處理好的等體積D101大孔吸附樹脂，濕法裝柱，去離子水平衡后加入“2.1.2”粗提液（1.53 mg/mL)，上樣液流量分別為 1、2、3、4 mL/min 進行動態(tài)吸附，收集并測定流出液中金銀花葉總黃酮的濃度，計算吸附率。

2.2.3.3 洗脫溶劑體積的選擇 按照 “2.2.3.2”方法裝柱5個，上樣流速選擇最佳值，吸附平衡后，洗脫溶劑流量 2 mL/min，分別以 2、3 、4、 5、 6 BV 60%的乙醇水溶液洗脫，測定流出液中金銀花葉總黃酮的濃度，計算解吸率。

2.2.3.4 洗脫溶劑濃度的選擇 操作同上，分別以體積分數(shù)為20%、40%、50%、60%、80%的乙醇水溶液，以流量2 mL/min進行洗脫，測定流出液中金銀花葉總黃酮的濃度，計算解吸率。

2.2.3.5 洗脫流速的選擇 操作同上，加入等體積60%的乙醇水溶液洗脫，流量為1、2、3、4 mL/min，測定流出液中金銀花葉總黃酮的濃度，計算解吸率。

2.2.3.6 Box-Behnken響應面法優(yōu)選金銀花葉總黃酮純化工藝 在單因素試驗基礎上，依據(jù)中心組合（Box-Benhnken）試驗設計原理，以上樣流速（A）、洗脫溶劑體積（B）、洗脫溶劑濃度（C）、洗脫溶劑流速（D）為自變量，總黃酮解吸率（Y）為評價指標進行設計（表1）。在優(yōu)化條件下，進行3次驗證試驗。

表1 Box-Behnken響應面試驗因素與水平表

2.2.3.7 純度測定 根據(jù)張星等（2018）的方法，按最優(yōu)工藝純化分離后得到的金銀花葉總黃酮進行純度測定：

純度=Cd×Vd×100%/m；

式中：Cd為解吸溶液中金銀花葉總黃酮的質量濃度，mg/mL；Vd為解吸溶液體積，mL；m 為干膏質量。

2.3 金銀花葉總黃酮的體外抗氧化活性試驗

2.3.1 DPPH自由基清除能力 參照姚新鼎等（2019）和夏娜等（2014）的測定方法并稍加修改。配制 DPPH乙醇溶液 （52.8μg/mL），取 1 mL DPPH乙醇溶液與1 mL不同濃度的樣品溶液或Vc溶液充分混勻，室溫下暗處放置30 min，在517 nm波長處測吸光度。計算公式如下：

DPPH 自由基清除率=1-（A1-A2）/A0；

式中：A1為樣品組吸光度，A2為樣品本底吸光度（以等體積無水乙醇代替DPPH溶液），A0為空白對照組吸光度 （以等體積蒸餾水代替樣品溶液）。

2.3.2 ABTS+自由基的清除能力 參照黃琴等（2014）和范艷麗等（2017）的測定方法并稍加修改。配制7 mmol/mL的ABTS+溶液，室溫下與等體積的4.9 mmol/mL過硫酸鉀溶液混合后暗處放置12 h，制成ABTS+儲備液，用pH 7.4的磷酸緩沖液稀釋儲備液20倍制成ABTS+工作液。取不同濃度的樣品溶液和Vc溶液 1 mL，加入 2.0 mL的ABTS+工作液，震搖均勻后常溫暗處放置10 min，在734 nm波長處測吸光度。計算公式如下：

ABTS+自由基清除率=1-（A1-A2）/A0；

式中：A1為樣品組吸光度，A2為樣品本底吸光度（以等體積蒸餾水代替ABTS+溶液），A0為空白對照組吸光度（以等體積蒸餾水代替樣品溶液）。

3 結果與分析

3.1 大孔樹脂的篩選 由表2可以看出，非極性大孔吸附樹脂D101、HPD-100的吸附性能均高于中級性和極性大孔吸附樹脂S-8和NKA-9，可達到65%以上。同時，大孔樹脂比表面積越大越有利于吸附 （王慧芳等，2018），D101型大孔吸附樹脂的比表面積稍大于HPD-100型大孔樹脂，兼顧吸附解吸性能，選擇D101型大孔吸附樹脂進行金銀花葉總黃酮的分離純化，并對其進行工藝條件優(yōu)化。

表2 大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附及解吸分析

3.2 D101型大孔吸附樹脂分離純化工藝優(yōu)選

3.2.1 泄露曲線測定 由圖1可以看出，上樣液體積為60~75 mL時吸光度增加0.01，大于75 mL時，金銀花葉總黃酮開始大量泄漏，因此最終確定漏點為60 mL，即為2倍柱體積。因此1 mL大孔吸附樹脂最大上樣量須小于2 mL。

3.2.2 上樣流速的選擇 由圖2可以看出，流速為2~3 mL/min時，黃酮類物質吸附率緩慢上升。流速大于3 mL/min時，黃酮類物質吸附率迅速下降。當上樣流速為1 mL/min時，黃酮吸附率為 85%，當上樣液流速為2 mL/min時，黃酮吸附率為84%。但是，當流速為1 mL/min時上樣較慢，上樣時間較長，可能會造成金銀花葉總黃酮的死吸附，使解吸率下降。當流速為3 mL/min時，上樣較快，容易導致黃酮類物質吸附不完全，造成損失。因此，選擇上樣流速為2 mL/min。

3.2.3 洗脫溶劑體積的選擇 由圖 3可以看出，當洗脫劑體積大于4 BV時，解吸率緩慢變化，即4 BV洗脫劑已經足以將金銀花葉總黃酮洗脫。洗脫劑用量過大時，造成浪費不經濟，并且減壓濃縮回收乙醇比較耗時，因此，洗脫溶劑體積選擇4 BV。

3.2.4 洗脫溶劑濃度的選擇 由圖4可以看出，當洗脫溶劑濃度為20%~60%時，解吸率隨乙醇濃度的增加而升高，當乙醇濃度繼續(xù)上升時，解吸率下降。其原因是黃酮類化合物與大孔吸附樹脂之間存在范德華力，當兩者極性接近時解吸率達到最大（王慧芳等，2018）。D101型大孔吸附樹脂為弱極性樹脂，金銀花葉總黃酮為弱極性分子，因此洗脫乙醇濃度越大，極性越小，越有利于金銀花葉總黃酮的洗脫，但是當乙醇的濃度繼續(xù)增加到80%時，金銀花葉總黃酮的解吸率反而降低，這主要是因為，醇溶性雜質隨之增多，導致總黃酮的解吸率下降，綜上，選擇60%的乙醇作為洗脫溶劑。

3.2.5 洗脫流速的選擇 由圖5可知，當洗脫劑流速為2 mL/min時，解吸率達到最大，當洗脫劑流速繼續(xù)增大反而使解吸率下降，主要原因是乙醇體積流量流速過大，洗脫液還未來得及洗脫樹脂上吸附的黃酮分子就已流了出去，因此選擇的洗脫流速為2 mL/min。

3.2.6 Box-Behnken響應面優(yōu)化D101型大孔吸附樹脂分離純化工藝

3.2.6.1 Box-Behnken響應面分析方案及試驗結果 響應面分析方案及試驗結果見表3。

表3 Box-Behnken響應面分析方案及試驗結果

3.2.6.2 模型的建立及顯著性檢驗 采用Design-Expert 8.0.5b軟件對表3中總黃酮解吸率進行多元回歸擬合，得金銀花葉總黃酮解吸率與A、B、C、D四因素變量的二次多元回歸模型為：

Y=85.40+1.65A+0.95B+1.37C+0.36D+0.26AB-0.97AC-0.67AD+0.17BC-0.20BD+0.26CD-0.76A2-2.87B2-2.77C2-2.65D2，對所得數(shù)據(jù)模型進行方差分析，結果見表4。

由表4可知，模型P＜0.01，是極顯著的，說明方程有意義，而失擬項P=0.0684，大于0.05，差異無統(tǒng)計學意義，即模型與試驗的差異較小，說明其他因素對試驗結果的干擾較小，殘差由隨機誤差引起，能充分反映各因素和響應值之間的關系（姚新鼎等，2019）。另外，總黃酮得率回歸方程的相關系數(shù)R2a為0.9853，校正系數(shù) R2adj=0.9706，均＞0.9，說明此模型能說明試驗中97.06%的響應值變化，因此可以用此回歸方程對D101型大孔吸附樹脂優(yōu)化金銀花葉純化工藝結果進行分析和預測。從單因素水平來看，各因素對D101型大孔吸附樹脂純化金銀花葉總黃酮解吸率影響的主次順序為：A＞C＞B＞D，即上樣流速＞洗脫溶劑濃度＞洗脫溶劑體積＞洗脫溶劑流速。響應面對于單因素A、B、C、D值構成的三維空間及其在二維平面上的等高線圖，可以直觀地反映各因素之間的相互作用，通過軟件處理得到的響應面見圖 6。

表4 Box-Behnken響應面方差分析結果

3.2.6.3 D101型大孔吸附樹脂最優(yōu)純化工藝和驗證試驗 通過Design-Expert 8.0.5b軟件對模型進行預測分析，得到最優(yōu)純化工藝：乙醇濃度為60.19%，乙醇體積為4.09倍柱體積，上樣流速為2.56 mL/min，洗脫流速為2.16 mL/min，在該條件下金銀花葉總黃酮的解吸率為86.1109%。為了實際操作可行性，最終將純化工藝條件修改為乙醇濃度為60%，乙醇體積為4倍柱體積，上樣流速為2.5 mL/min，洗脫流速為2 mL/min。對響應面優(yōu)化的分離純化工藝參數(shù)進行驗證試驗，制備3批樣品，金銀花葉總黃酮的解吸率分別為86.52%、87.09%和85.77%。選用優(yōu)化后的樹脂純化工藝參數(shù)進行試驗的3批樣品，金銀花葉總黃酮的解吸率基本穩(wěn)定，可用于金銀花葉總黃酮的大規(guī)模分離純化。

3.2.6.4 純度測定 根據(jù)純化工藝參數(shù)進行驗證試驗，制備3批樣品的金銀花葉總黃酮的純度見表5。

表5 三批金銀花葉總黃酮純度

3.3 抗氧化試驗結果

3.3.1 DPPH自由基清除能力試驗結果 由圖7可知，總黃酮質量濃度為0~28.6μg/mL時，隨著總黃酮質量濃度的增加，DPPH自由基清除率隨之增加。當總黃酮質量濃度為22.88μg/mL時，對DPPH自由基清除率達到82.40%，陽性對照Vc為77.02%。以上結果表明金銀花葉總黃酮對DPPH自由基有良好的清除的能力。金銀花葉總黃酮清除DPPH自由基的機理可能是因為黃酮樣品中具有供氫體，可以提供質子還原具有氧化性的自由基，終止自由基的連鎖反應，起到抑制或清除自由基的作用（羅磊等，2018）。

3.3.2 ABTS+自由基的清除能力試驗結果 由圖8可知，總黃酮質量濃度為0~35.75μg/mL時，隨著總黃酮質量濃度的增加，ABTS+自由基清除率隨之增加。當總黃酮質量濃度為21.45μg/mL時，對ABTS+自由基清除率達到92.01%，之后在總黃酮質量濃度為28.60~35.75μg/mL時，ABTS+自由基清除率保持相對穩(wěn)定?？傸S酮質量濃度為35.75μg/mL時，對ABTS+自由基清除率達到91.32%，高于同濃度陽性對照Vc對ABTS+自由基清除率85.97%。以上結果說金銀花葉總黃酮具有很高的清除ABTS+自由基的能力。

4 討論

本試驗利用響應面法優(yōu)化了D101大孔吸附樹脂制備華金6號金銀花葉總黃酮有效部位的工藝，得到最佳制備方案：粗提液上樣流速為2.5 mL/min，洗脫溶劑為60%乙醇，洗脫溶劑體積為4倍柱體積，洗脫流速為2 mL/min；此方法總黃酮提取率與響應面預測值非常接近，純度可達60%以上，工藝穩(wěn)定可行，可為華金6號新品種金銀花葉總黃酮類成分的大規(guī)模生產提供參考。

黃酮類化合物分離純化的方法有很多種，氧化鋁層析法、聚酰胺吸附樹脂吸附法、大孔樹脂吸附法等，與其他方法相比，大孔吸附樹脂具有成本低、分離效率高、操作簡單、無毒性、可工業(yè)化大批量生產等優(yōu)點，已廣泛應用于黃酮類成分的純化 （向海燕等，2017；張華潭，2015）。因此，本試驗采用D101型大孔吸附樹脂對金銀花葉進行分離純化，為金銀花葉總黃酮類成分的開發(fā)提供基礎。

響應面法是一種綜合試驗設計和數(shù)學建模的優(yōu)化方法，可有效地減少試驗次數(shù)，縮短試驗周期，分析結果直觀清晰，且可考察各因素之間的交互作用。本試驗通過Box-Behnken響應面法對金銀花葉總黃酮純化工藝進行優(yōu)選，準確地得到最佳純化方案，此純化方案為以后的大規(guī)模生產提供參考。

體外抗氧化活性試驗表明在一定質量濃度范圍內華金6號金銀花葉總黃酮有效部位的體外抗氧化能力隨質量濃度的增大而增強，并呈劑量依賴性，與羅磊（2018）的研究結果一致。純化后的金銀花葉總黃酮的ABTS+自由基清除能力高于同濃度的Vc清除能力，DPPH自由基的清除能力接近同濃度的Vc清除能力，金銀花葉黃酮具有良好的體外抗氧化性。