FISH 技術在乳腺癌HER-2 基因檢測中的應用價值評估

鞠薇薇

乳腺癌在女性惡性腫瘤發病率居第一位,且發病率近年來逐年提高,發病群體日益年輕化［1］。原癌基因HER-2 是目前惡性腫瘤研究的重點之一,已有許多文獻報道指出20%～30%的乳腺浸潤癌中有HER-2 基因的過表達現象［2,3］。HER-2 基因狀態對乳腺癌患者的預后、風險評估、內分泌治療、化療、生物靶向治療等均有顯著影響。HER-2 基因是乳腺癌的重要分子標志物和治療靶,準確把握HER-2 基因信息有利于指導臨床醫師治療［4］。對此,本研究對比分析兩種HER-2 基因檢測方法,探索HER-2 基因檢測中IHC與FISH 檢測的一致性,現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇本院婦產科2016 年1 月～2019 年6 月診治的50 例新發乳腺癌患者作為研究對象,均為女性,經HE 染色制片確診為浸潤性乳腺癌,未接受術前輔助化學治療等。年齡36～69 歲,平均年齡(54.3±6.1)歲；其中浸潤性導管癌45 例,浸潤性小葉癌5 例。

1.2 方法 經手術切除或粗針穿刺活檢獲取的乳腺癌標本分成2 份,分別采用FISH 技術和IHC 技術進行HER-2 基因檢測。具體如下。

1.2.1 FISH 技術 將標本切片使用二甲苯脫蠟至水化,然后在室溫下依次采用100%、85%、70%的乙醇梯度脫水,各脫水2 min,然后在去離子水中浸泡30 min,在50℃下浸入30%酸性亞硫酸鈉溶液30 min,使用2×SSC 緩沖液洗片2 次后,將切片置入37℃蛋白酶K溶液中浸泡4～10 min,然后再次洗片后置入0.1 mol/L鹽酸(HCl)中,室溫下浸泡5～10 min。洗片后將切片依次在-20℃的70%、85%、100%乙醇中脫水各2 min,室溫下浸入丙酮2 min,然后在空氣中自然風干切片,然后56℃烤片5 min,滴加10 μl 探針混合液到切片上,73℃變性5 min 后在原位雜交儀中雜交,42℃濕盒雜交過夜14～18 h,然后分別使用2×SSC、0.3%、NP-40 洗滌液中洗片,洗去多余的探針,然后在室溫下暗處干燥,滴加10 μl 4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)顯色液復染,蓋玻片后在熒光顯微鏡下觀察。

1.2.2 IHC 技術 標本切片常規脫蠟至水化,將切片置入枸緣酸鈉緩沖液中,微波加熱2 次,5 min/次,修復抗原,待切片自然冷卻到室溫后,使用PBS 緩沖液洗片3 次,滴加工作濃度的一抗,放入預熱濕盒中,37℃,60 min,PBS 沖洗；滴加辣根過氧化物酶標記的二抗,37℃下孵化30 min,用PBS 洗脫；滴加100 μl 二氨基聯苯胺(DAB)顯色液,自來水沖洗；蘇木素復染,封片,在鏡下觀察。

1.3 觀察指標 觀察IHC 與FISH 檢測結果、FISH檢測17 號染色體多體發生情況。

1.4 結果判讀 ①IHC：C-erbB-2 陽性為+++,>30%的腫瘤細胞呈現強而完整的細胞膜著色；可疑為++,陰性為+或0 表達。(2)FISH：計數30 個細胞統計Ratio 值,當Ratio 值<1.8 時為陰性,表示無HER-2 基因擴增；Ratio 值>2.2 時為陽性,存在HER-2 基因擴增；Ratio值在1.8～2.2 之間時可選擇計數細胞100 個再次統計Ratio 值。

1.5 統計學方法 采用SPSS22.0 統計學軟件對研究數據進行統計分析。計算Kappa 值進行一致性檢驗；計數資料以率(%)表示,采用χ2檢驗。P<0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 IHC 與FISH 檢測結果 IHC 結果為+++、++、+/0 時,IHC 與FISH 檢測結果的陽性符合率分別為87.50%、94.59%、20.00%。在IHC 檢測為+++、++的標本中,FISH 檢測中有93.33%(42/45)顯示為HER-2基因擴增；在IHC 檢測為+/0 的標本中,FISH 檢測中有20.00%(1/5)顯示為HER-2 基因擴增。經一致性檢驗,IHC 與FISH 檢測結果一致性較好(Kappa 值=0.543,P<0.05)。見表1。

表1 IHC、FISH 檢測結果(n,%)

2.2 FISH 檢測17 號染色體多體發生情況 50 例患者中,經FISH 檢測發現,17 號染色體總多體發生率為18.00%(9/50),其中在IHC 檢測HER-2 高表達(+++、++)患者中的多體發生率為17.78%(8/45),在HER-2 低表達或無表達(+、0)患者中的多體發生率為20.00%(1/5),比較差異無統計學意義(χ2=0.015,P=0.902>0.05)。

3 討論

乳腺癌是嚴重威脅女性生命健康的惡性腫瘤,其發病率近年來逐年提高。HER-2 基因是原位基因,又被稱為C-erbB 基因,其與乳腺癌的發病、發展、預后密切相關。HER-2 基因的擴增表達檢測越來越受到臨床重視,稱為乳腺癌臨床治療、預后判斷的重要輔助手段［5］。目前臨床上進行HER-2 基因檢測的方法主要是IHC 技術和FISH 技術,IHC 是以組織為基礎的蛋白檢測方法,HER-2 基因擴增的腫瘤細胞存在明顯的膜著色,而含有正常HER-2 基因拷貝數的乳腺癌在不會有特殊的著色反應。IHC 方法操作簡單、費用低廉、可重復性好,且對相關材料要求不高；但是由于蛋白在標本固定、處理過程中易變性破壞等,從而影響檢測結果；加上抗體的不同批號差異以及結果判斷的主觀性等,使得IHC 技術在檢測中易出現假陰性、假陽性問題,影響臨床診療［6］。FISH 技術是一門新興的分子細胞遺傳學技術,其被廣泛用于動植物基因組結構研究、染色體精細結構變異分析、病毒感染分析等領域中,其以組織為基礎,適用于石蠟包埋的組織塊,通過檢測基因拷貝數來評估HER-2 基因水平,是HER-2基因檢測的金標準［7］。與IHC 技術相比,FISH 技術有如下優勢：對低倍、高倍和染色體非整倍性的擴增檢測均有較高的準確率,靈敏度、特異度高,結果為雙色熒光信號,能避免綠色熒光的干擾,直接準確得到基因擴增的拷貝數,是目前HER-2 基因擴增的金標準。

本次研究結果顯示：IHC 與FISH 檢測結果一致性較好(Kappa 值=0.543,P<0.05),而IHC 技術具有操作簡單、費用低等優勢,而FISH 技術檢測步驟繁瑣、要求高,故而IHC 可以作為了解乳腺癌患者HER-2 基因擴增及表達的重要篩查方法,對于檢測結果為無表達或低表達(0/+)的患者,可以不做FISH 檢測,而對于IHC 檢測結果為高表達(+++、++)的患者,則需進一步做FISH 檢測確診。

17 號染色體多體的定義尚未形成共識,但多數學者認為當平均每個細胞中的17 號染色體≥3 個時,即17 染色體多體［8］。17 號染色體僅經雙探針原位雜交法才能反映,單探針法無法反映。本研究結果顯示：17 號染色體多體總發生率為18.00%,IHC 為高表達的17 號染色體多體發生率與低表達或無表達的17 號染色體多體發生率比較差異無統計學意義(P>0.05)。作者認為,17 號染色體的多體可能是造成IHC 與FISH技術檢測結果不一致的原因之一,如果存在17 號染色體多體,即使是IHC 檢測為+++、++,經FISH 技術檢測也可能出現無擴增或低擴增現象,引起假陰性結果,影響臨床診療。

綜上所述,乳腺癌HER-2 基因檢測中IHC 與FISH 技術檢測的結果一致性較好,但17 號染色體多體可能是導致兩種方法檢測結果不一致的原因之一,臨床醫師應結合患者的實際情況選擇合適的基因檢測方法,FISH 技術可以作為HER-2 基因擴增的確診手段應用。