川滇高山櫟氮磷含量快速測定研究

肖 聰，陳小玲,方睿霞,高艷菊,張 東,王石發,王保秀,楊青松*

（1.云南民族大學民族藥資源化學國家民委教育部重點實驗室，云南 昆明 650500；2.云南民族大學民族醫藥學院，云南 昆明 650500）

近年來連續流動分析儀被大量應用于各個領域，如測定土壤氨氮、硝態氮和有效磷[1-2]，測定水中氨氮的方法比較[3]、復混肥料中硝態氮[4]，同時測定橡膠葉全氮、全磷、全鉀的方法研究[5]，快速測定全氮、全磷含量[6-7]。AA3連續流動分析儀擁有先進的自動化技術優勢和超700種被認證的方法應用，由于自動化和模塊化設計，AA3可以很容易地適應各實驗室特殊的技術和實驗要求，可根據相應方法分析40～100個樣品/h，120～180個樣品/d。能夠分析各類型澄清液體樣品，如水（海水/自來水/廢水）、土壤（浸提液/消煮液）、植物（消煮液）、食品（飲料）、肥料、化合物等。

川滇高山櫟 (Quercus aquifolioides Rehd.et Wils.)系殼斗科櫟屬的植物。分布于云南、西藏、貴州、四川等地，常生長在山坡向陽處或高山松林下[8]。常與其他高山櫟類樹種混生，是我國西部和西南部青藏高原東緣以及橫斷山地區所特有的一種植被類型，其分布區內對環境條件有極強的生態適應性，使得東喜馬拉雅和橫斷山地區的森林覆蓋率大大增加，在當地生態系統中起著至關重要的作用[9]。前人對川滇高山櫟研究多集中在生態功能研究方面[10-13]，對川滇高山櫟植物營養方面的研究較少，其中利用AA3型連續流動分析儀快速測定高山櫟枝葉氮磷養分方面的研究尚未見報道。本文對AA3型連續流動分析儀測定川滇高山櫟枝葉消解樣品中全氮/全磷含量的方法進行研究，獲得高效、精確的方法，以提高AA3型連續流動分析儀測定川滇高山櫟全氮/全磷養分含量的質量和效率。

1 材料與方法

1.1 材料

供試樣品：川滇高山櫟枝葉試驗樣品，均為野外采集；采樣點為云南省昆明市祿勸縣轎子雪山。國家一級標準物質：GBW07603（GSV-2）灌木枝葉購自中國地質科學院地球物理地球化學勘查研究所。

實驗試劑：鉬酸銨(NH4)6Mo7O24·4H2O、磷酸二氫鉀KH2PO4、抗壞血酸C6H8O8、酒石酸銻鉀K(SbO)C4H4O6·1/2H2O、硫酸鉀 K2SO4、十二烷基硫酸鈉（SDS）C12H25NaO4S、優級純、10%次氯酸鈉NaOCl、濃硫酸H2SO4（比重 1.84）、濃鹽酸 HCl（比重 1.18）、30%過氧化氫 H2O2、硫酸銨 (NH4)2SO4、Brij-35 溶液 22%、硫酸鉀K2SO4、氫氧化鈉NaOH、磷酸氫二鈉 Na2HPO4、水楊酸鈉 Na2C7H5O3、硝普鈉 Na2[Fe(CN)5NO]·2H2O、酒石酸鉀鈉C4H4KNaO6·4H2O。 除特殊說明外所有試劑為分析純，水為去離子水。

主要實驗儀器：AA3型連續流動分析儀CFA，由德國SEAL公司生產，二通道，均為 MT7模塊；SH230N石墨爐重金屬消解儀 （可控溫控時，配套30根100mL玻璃消煮管）；WGL-125B電熱鼓風干燥箱（可控溫控時）。

1.2 方法

1.2.1 樣品待測液的制備

前處理：將采集的新鮮高山櫟枝葉放入105℃烘箱中殺青30 min，再用75℃烘干至恒重（需要8～12 h）。最終粉碎后裝入密封袋。

消煮具體步驟：采用硫酸-過氧化氫法消煮植物樣，精密稱取樣品和標準物質0.0500 g于50 mL刻度的玻璃消煮管中，加入0.5 mL去離子水，潤濕樣品后加入1.2mL濃H2SO4，搖勻，靜置過夜。消煮程序：150℃ 1h，200℃ 1h，240℃ 1.5h，消煮至樣品呈黑醬油狀態。將消煮管取出稍微冷卻約1 min后，在溶液中間加過氧化氫10滴，邊滴加邊搖勻，直至消煮液變為更澄清的黑醬油狀態，基本沒有固體。再加5滴過氧化氫，消煮液顏色呈深黃色的澄清液體。樣品統一滴加過氧化氫的滴數和次數，反復消化，直至變無色后繼續再消化20 min除去殘留的過氧化氫。最后加去離子水約50 mL于消解管中，待冷卻穩定后轉移至100 mL帶蓋比色管中定容及混勻（酸度為1.2%H2SO4）。同時做空白試驗，標準物質和樣品同樣處理。將制備好的待測液于4℃冰箱保存。

1.2.2 全氮和全磷標準溶液配制[14～15]

全氮標準貯液（1000 mg N/L）：精密稱取已在烘箱130℃烘3h的硫酸銨4.717 g，溶于600 mL去離子水中，定容至1L后搖勻，于4℃冰箱保存。全磷標準貯液（1000 mg P/L）：精密稱取已在烘箱130℃烘3h的磷酸二氫鉀4.394 g，溶于600 mL去離子水中，定容至1L后搖勻，儲于4℃冰箱保存。

取全氮標準貯液 （1000 mg N/L）0、0.2、0.4、0.6、0.8 mL 和全磷標準貯液（1000 mg P/L）0、0.1、0.2、0.3、0.4mL于5個100 mL的容量瓶中，在每個容量瓶中加空白消煮液1.2 mL，用去離子水定容后搖勻。 其中含 N：0、2、4、6、8 mg/L，含 P：0、1、2、3、4 mg/L。

1.2.3 AA3型連續流動分析儀操作步驟[16]

CFA具體操作步驟參照操作規程按部進行，簡單步驟為：開主機開泵，預熱2h，待氣泡穩定后打開軟件、進樣器和檢測器，待泵停下后點圖表選擇分析方法，出現運行頁面，關閉不需要的通道運行頁面。設置燈值和基線，待水基線穩定在5%（約30min），放入試劑，檢查試劑吸收（12 min 左右），試劑吸收滿足條件后設置增益（約15 min），增益成功后設立分析方法，關閉通道運作分析文件，運行結束后取回報告，輸出并分析數據，最后用系統清洗液慢速清洗管路15 min。

本次試驗測全氮全磷含量時，儀器所使用的通道為channel-2通道，基線默認5%，增益初始值為10（增益值應小于100，不然峰形不穩定），增益最高峰為85%，視圖平滑度設為16，設置了漂移基線校正杯和帶過杯。測定樣品時要先檢查試劑吸收和儀器靈敏度。試劑吸收和儀器靈敏度公式為：相對于水的試劑吸收值=[試劑吸收（%）-水基線（5%）]/100%；設置試劑基線為5%，泵入氮磷標準最高杯，當標準溶液到達檢測器且峰信號出現時，記錄其峰高（%），則靈敏度=[最高標曲峰高（%）-試劑基線（5%）]/100%，靈敏度結果會在樣品運行結束后自動計算，出現在實驗分析報告上。

1.2.4 統計分析

所有實驗數據均采用Excel 2013軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 試劑配制方法的調整和特性參數的設置結果

參照儀器所附方法和文獻[5,14-15]，試劑配置方法做了相應的調整 （樣品消解后最終酸度為1.2%H2SO4）。根據最終樣品酸度，全磷全氮進樣器清洗液為1.2%H2SO4（試劑管①，圖1），空氣管為②⑤，進樣管為④或⑦。

全氮的試劑配制方法：

未做改變的試劑為水楊酸鈉溶液 （試劑管⑧，圖1），稀釋水為去離子水（試劑管⑩）；其余試劑作如下調整：緩沖溶液（試劑管③⑥，圖1）稱取35.3 g十二水磷酸氫二鈉和50 g酒石酸鉀鈉溶于400 mL的去離子水中，用小燒杯稱取22 g氫氧化鈉，轉移至上述溶液中，混合均勻后后稀釋至1 L。最后在瓶中加入2.73 mL Brij-35（22%）。要盡快用完，即使放入4℃冰箱，一天后出現渾濁，不可使用；次氯酸鈉溶液（試劑管⑨，圖1）配制方法為取10%次氯酸鈉10mL，用9.05 mL的去離子水稀釋成5.25%次氯酸鈉，取7 mL 5.25%次氯酸鈉溶液至60 mL水中，稀釋至100 mL，混勻，每天更新。通過試劑配制調整，全氮反應尾液最終pH值為12.89，符合要求。

全磷的試劑配制方法：

未改變試劑為抗壞血酸溶液（試劑管⑩，圖1），稀釋水為去離子水（試劑管⑧，圖1）；將儀器所附方法中鹽溶液配置的酸去掉，將酸溶液換成系統清洗液，鉬酸銨溶液（試劑管⑨，圖1）配制方法為：將71 mL的濃硫酸緩慢加入800 mL的去離子水中，將6.2 g鉬酸銨溶于其中，將溶解于水中的0.17 g酒石酸銻鉀溶液加入上面溶液，最后稀釋至1000 mL（其中含2.6 mol/L的1/2 H2SO4），混勻后儲于棕色瓶，每周更新。要將酒石酸銻鉀先溶解再與其他溶液混勻，這樣更容易溶解，試劑吸收也會更低；鹽溶液（試劑管⑥，圖1）配制方法為將5 g氯化鈉溶于700 mL的去離子水，并稀釋至1 L；系統清洗液為0.2%SDS（試劑管③，圖 1）：因 SDS的量影響試劑吸收，所以將2g SDS的量改為1g。

此次實驗全氮和全磷用的都是高濃度進樣管進樣，測定范圍為全氮 0～12 mg/L，全磷 0～6 mg/L。測定速率為50個樣/h，比儀器方法60個樣/h要小，使得增益值良好且視圖更穩定。由表1可知，氮磷的靈敏度分別為0.364和0.2764，均大于儀器方法要求的（全氮0.30，全磷0.16）。氮磷的試劑吸收分別為0.019和0.007，均小于儀器方法要求的（氮磷都為0.02）。氮全的帶過% 分別為0.13%和0.37%，均小于儀器方法要求的（全氮0.5%，全磷1.2%）。

2.2 標準曲線的繪制結果

全氮全磷標準曲線繪制的方程分別為：y＝-0.0002x2+7.2793x+5.0447 和 y＝0.0014x2+15.0736x+18.7397。由圖2可看出氮磷標曲線性良好，R2均為 1.0000，高于儀器的線性要求（N:0.9991，P:0.9999），表明AA3型連續流動分析儀可以快速且準確地測定氮磷混合標準系列濃度。全氮/全磷標準曲線的空白均高于原點（圖2），這是為了使標曲溶液和樣品成分一致，在標曲系列中加了消解的空白樣的原因。

表1 CFA測定全氮/全磷方法的特性參數設置Table 1 The characteristic parameter for determination of total nitrogen and total phosphorus by CFA

2.3 方法精密度測試結果

用CFA分別測定5種不同全氮/磷濃度梯度的待測液，重復測定10次，計算其平均值、標準偏差和變異系數 （見表2）。氮磷的標準偏差分別在0.017～0.038 mg/L 和 0.002～0.004 mg/L 范圍內，滿足儀器方法要求 （N:0.03 mg/L，P:0.0032 mg/L），全氮/全磷的變異系數（%）分別在0.276～0.776和0.552～0.919之間，均小于1%，表明具有較好的重現性。

表2 CFA測定全氮/全磷方法的重復性Table 2 Repeatability for determination of total nitrogen and total phosphorus by CFA

表3 CFA測定全氮/全磷方法的最低檢出限Table 3 The lowest detection limit for determination of total nitrogen and total phosphorus by CFA

表4 CFA測定全氮/全磷方法的空白加標回收率Table 4 The blank spike recovery of determination of total nitrogen and total phosphorus by CFA

2.4 方法最低檢出限的測試結果

根據EPA（美國環保協會）測定檢出限的程序[17]，計算標準系列最高點濃度 （N:2mg/L，P:4 mg/L）*2%的濃度值 （N:0.2000 mg/L，P:0.08 mg/L）， 利用AA3連續流動分析儀重復測定該值10次 （如表3）。 10次平均值為 N:0.0097mg/L，P:0.0887 mg/L，標準偏差為N:0.0034，P:0.0032，相對標準偏差% 為N:1.6132%，P:2.9105%；檢出限=標準偏差 *2.86，氮磷檢出限分別為：N:0.0097mg/L，P:0.0092 mg/L，達到了儀器給出的方法檢測極限（N:0.011mg/L，P:0.02 mg/L）。

2.5 空白加標回收率的測試結果

重復測量3次4個空白樣的全氮/全磷濃度，用這4個空白樣配置成空白加標待測液 （濃度為N:2、4、6、8 mg/L，P:2.5，3，3.5，4.0 mg/L）。 用AA3連續流動分析儀重復測量3次空白加標待測液的氮磷含量。空白加標回收是一種自控的質量控制試驗，空白加標回收率結果如表4。由表可看出，全氮全磷的空白加標回收率分別在94.2%～100.5%和6.8%～100.5%之間。

表5 CFA測定全氮/全磷方法的相對準確度Table 5 Relative accuracy for determination of total nitrogen and total phosphorus by CFA

2.6 方法準確度的測試結果

根據區域地球化學勘察樣品分析方法[19]上對于方法準確度參數的測量與統計，稱取國家標準物質（做3個平行樣），和樣品一起消解并重復測量3次其全氮/全磷濃度，與國家一級標準物質GBW07603（GSV-2）全氮/全磷認定值（N:15g/kg，P:1g/kg）比較，計算標品的平均值、標準偏差（SD）、相對標準偏差（RSD）和相對準確度結果（如表5）。由表可知，經國家一級標準物質（GSV-2）驗證，氮磷的測定結果與標準值吻合，全氮的方法相對準確度范圍在99.22%～99.68%之間，全磷的方法相對準確度在99.76%～105.32%之間，表明具有較好的方法相對準確度。

3 討論

本實驗所用的CFA測定全氮/全磷方法兩天可成功分析250個川滇高山櫟樣品，很好地提高了實驗效率。當一次測量的樣品＞100個樣品，每個樣品測2～3次，最終要測200～300次。為了使實驗數據更加準確[5]，每30個樣品最好插入一組漂移/基線校正杯。當然，儀器方法和實驗數據的準確性是基于多種因素的，如樣品的正確前處理、標準的準確性、儀器的穩定性、試劑的正確配置、試劑吸收和交叉污染等等，缺一不可，每一個細節都要注意。

消煮時要根據消煮液最后的顏色和澄清度，適當加溫度或過氧化氫的用量。剛開始只能低溫加熱，微沸即可，爆沸會使樣品濺得過高，樣品損失，消煮難度也加大。建議一天最好只測一批樣品(150個樣品/3h)，清洗管路后再繼續測第二批樣時，雖省去儀器預熱的時間，但因儀器工作時間過長，此時儀器的穩定性和泵管的彈性都不太理想，實驗結果很多時候也不滿足要求（如帶過高，視圖曲線不穩定等）。

標準樣品必須含有與樣品及樣品清洗液同樣的基體，使酸度基本一致，保證樣品和標樣的一致性。根據樣品待測液酸度來調整試劑里需要添加的酸堿的量,全氮反應混合液（尾液）最終pH值要在12.8～13.1之間。全磷反應混合液最終顯色酸度[H+]0.35～0.55 mol/L[20]。全磷試劑吸收很容易高，鉬酸銨溶液配置中鉬酸銨溶于酸中時的試劑吸收比溶于水中的要低[21]，但酒石酸銻鉀不易溶于酸中，易溶于水，所以先將其溶于水中再混合，這樣不僅省時間還能降低試劑吸收。

4 結論

對AA3型連續流動分析儀所附方法和文獻報道的磷氮測定方法進行了具體改進后，用來測量川滇高山櫟林枝葉樣品待測液（硫酸-過氧化氫法消煮）中全氮/全磷含量。結果表明：CFA測定全氮/全磷方法的試劑吸收、靈敏度、帶過%均滿足儀器所附方法要求，基線穩定無雜峰，視圖中峰形平滑且規律。全氮/全磷標準系列線性良好，相關系數達到了1.0000，高于儀器的線性要求；氮磷的標準偏差范圍為 0.017～0.038 mg/L 和 0.002～0.004 mg/L，變異系數范圍為 0.276～0.776%和0.552～0.919%，均小于1%（n＝10），具有較好的重現性；方法檢出限分別為：N:0.0097mg/L P:0.0092 mg/L （n＝10），滿足儀器所附要求；氮磷空白加標回收率范圍在94.2%～100.5% 和 96.8%～100.5%之間（n＝3）；經國家一級標準物質（GSV-2）驗證，氮磷測定值與標準值吻合，全氮的方法相對準確度范圍在99.22%～99.68%之間，全磷的方法相對準確度在99.76%～105.32%之間（n＝3），具有較好的方法相對準確度。