超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定畜禽產(chǎn)品中15種鎮(zhèn)靜類(lèi)藥物殘留

王 京，葉佳明，王 瀟，鐘世歡，陳青俊

（1.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310030；2.浙江公正檢驗(yàn)中心有限公司，浙江杭州 311305）

0 引言

隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展和生活水平的不斷提高，人們對(duì)肉制品、奶制品和魚(yú)制品等動(dòng)物性食品的品質(zhì)要求也越來(lái)越高，然而為了預(yù)防或治療畜禽、提高產(chǎn)量而大量投入化學(xué)藥物造成藥物殘留于動(dòng)物組織中，伴隨而來(lái)的是對(duì)公眾健康和環(huán)境的潛在危害。近年來(lái)食品安全事件頻發(fā)，對(duì)食品的獸藥殘留引起了普遍關(guān)注，并認(rèn)為獸藥殘留將是今后食品安全性中重要問(wèn)題之一[1-2]。鎮(zhèn)靜類(lèi)藥物可用于抗暈眩、鎮(zhèn)吐等，飼料中添加此類(lèi)藥物，能興奮攝食中樞，不法商人在動(dòng)物養(yǎng)殖過(guò)程中非法使用，以達(dá)到增加動(dòng)物采食、促進(jìn)生長(zhǎng)、增加體重等作用；另外，使用該藥物可降低動(dòng)物運(yùn)輸過(guò)程中的死亡率。2012年在對(duì)動(dòng)物源性食品鎮(zhèn)靜類(lèi)藥物及其代謝物殘留量普查時(shí)發(fā)現(xiàn)，35%的豬肉內(nèi)都含有微量異丙嗪亞砜。殘留的氯丙嗪、異丙嗪和部分具有原藥活性的代謝物，能引起白細(xì)胞減少和粒細(xì)胞缺乏癥，從而引起人體肝臟、腎臟的病變，還會(huì)引起眼部并發(fā)癥等[3]。目前鎮(zhèn)靜類(lèi)藥物在養(yǎng)殖業(yè)中的使用已經(jīng)引起了美國(guó)、歐盟和日本等國(guó)家的高度重視。日本厚生勞動(dòng)省于2005年6月21日，向各世界貿(mào)易組織（WTO） 成員通報(bào)了“臨時(shí)最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)”“一律基準(zhǔn)”“豁免物質(zhì)”最終草案-G/SPS/N/JPN/145。其中，9種動(dòng)物源性產(chǎn)品評(píng)估表將鎮(zhèn)靜類(lèi)藥物中的氯丙嗪列為“高貿(mào)易影響程度”的藥物，明確規(guī)定在動(dòng)物源性食品中該類(lèi)藥物及其代謝產(chǎn)物均不得檢出[4]。

目前，有關(guān)畜禽產(chǎn)品中多種鎮(zhèn)靜類(lèi)藥物的測(cè)定方法還較少，僅有一些少量文獻(xiàn)與異丙嗪、氯丙嗪及其代謝物相關(guān)，大部分研究局限于法醫(yī)學(xué)方面。近些年，國(guó)內(nèi)外對(duì)于該類(lèi)藥物的檢測(cè)主要采用LCMS/MS法[5-7]和GC-MS法，有研究人員利用GC/MS測(cè)定豬肝中的氯丙嗪殘留量，RSD＞5%，精密度不理想[8-9]；2008年發(fā)布的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1458—2007的檢出限為 0.2～1.0 mg/kg，靈敏度不高[10]；Yadollah Yamini等人[11]將磁性固相萃取技術(shù)（MSPE） 與高效液相色譜技術(shù)（HPLC）聯(lián)用測(cè)定水、尿、血漿中的痕量氯丙嗪含量，樣品對(duì)象主要為血液和尿液，相對(duì)食品樣品基質(zhì)比較干凈；Jessica J W Broeders等人[12]用HPLC-MS/MS測(cè)定類(lèi)似藥物在豬腎等中的殘留，藥物種類(lèi)較少且方法適應(yīng)性不理想。目前尚無(wú)對(duì)同時(shí)測(cè)定畜禽肉中15種鎮(zhèn)靜類(lèi)藥物的共同研究。旨在建立一種利用簡(jiǎn)單快速的分散固相萃取凈化方法，基于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLCMS/MS）技術(shù)，實(shí)現(xiàn)同時(shí)測(cè)定15種鎮(zhèn)靜類(lèi)藥物殘留。該方法簡(jiǎn)便快速，靈敏度、精密度和準(zhǔn)確度滿(mǎn)足實(shí)際樣品的檢測(cè)需要。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260Ⅱ型超高效液相色譜-6470三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Agilent公司產(chǎn)品；Centrifuge 5804R型高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品；MS2型旋渦振蕩器，德國(guó)IKA公司產(chǎn)品；AS 3120型超聲波振蕩器，天津特賽恩斯儀器有限公司產(chǎn)品；N-EVAP112型水浴式氮吹儀，美國(guó)Organomation公司產(chǎn)品；Millipore-iQ型高純水凈化儀，美國(guó)Millipore公司產(chǎn)品。

甲醇、乙腈、乙酸乙酯、甲酸為色譜純，德國(guó)MERCK公司提供；硫酸鎂、氯化鈉、EDTA為分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司提供；二乙烯苯/N-乙烯基吡咯烷酮共聚物（HLB）） 吸附劑，美國(guó)Waters公司提供；實(shí)驗(yàn)用水，Millipore-iQ高純水凈化儀制得。

15種鎮(zhèn)靜類(lèi)藥物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（特非那定、西替利嗪、賽庚定、氯雷他定、地氯雷他定、阿司咪唑、氯丙嗪、異丙嗪、氟奮乃靜、氯苯那敏、奮乃靜羥嗪、溴苯那敏、曲吡那敏、苯海拉明），德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司提供。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

將15種鎮(zhèn)靜類(lèi)藥物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用乙腈分別配制成100 μg/mL左右質(zhì)量濃度的儲(chǔ)備液，-18℃條件下避光保存；按需要用初始比例的流動(dòng)相稀釋成適當(dāng)質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，臨用配制。

1.3 預(yù)處理方法

準(zhǔn)確稱(chēng)取制備均勻的試樣5.00 g（精確到0.01 g）于50 mL聚丙烯離心管中，準(zhǔn)確加入20.0 mL的混合提取液（乙酸乙酯∶乙腈提取液=20∶80），勻漿1 min后超聲提取10 min，以轉(zhuǎn)速8 000 r/min離心3 min，取上清液加入1 g二乙烯苯/N-乙烯基吡咯烷酮共聚物吸附劑，渦旋1 min后靜置，取全部清液加入5 g鹽析劑（NaCl∶MgSO4為1∶4），渦旋1 min后以轉(zhuǎn)速8 000 r/min于4℃下低溫離心3 min；取上清液在40℃水浴中氮吹至近干，加入2.0 mL初始比例的流動(dòng)相（含0.1 mol/L EDTA） 復(fù)溶，過(guò)0.22 μm濾膜供LC-MS/MS測(cè)定。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備

取同類(lèi)陰性樣品，按照1.3方法處理濃縮至近干，加入1.2配制的標(biāo)準(zhǔn)混合工作液2.0 mL，按1.3方法繼續(xù)操作即得。

1.5 UPLC-MS/MS測(cè)定

液相色譜條件：Poroshell 120 EC-C18柱（100 mmL×2.1 mm ID，2.7 μm），柱溫35℃，流速0.25 mL/min，進(jìn)樣量2 μL，流動(dòng)相A相為0.1%甲酸水溶液，B相為0.1%甲酸乙腈溶液；梯度洗脫程序0～3 min，10%～10%B；3～6 min，10%～30%B；6～8 min，30%～40%B；8～12 min，40%～70%B；12～14 min，70%～90%B；14～16 min，90%～90%B；16～16.1 min，90%～10%B。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源正離子掃描模式（ESI+），干燥氣流速10 L/min，干燥氣溫度300℃，鞘氣流速15 L/min，鞘氣溫度250℃，霧化器壓力30 psi，毛細(xì)管電壓4 500 V，質(zhì)譜分辨率為unit，動(dòng)態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（DMRM）模式采集。

15種藥物的質(zhì)譜采集參數(shù)見(jiàn)表1。

定量方法：先取1.4制備的溶液2 μL上機(jī)測(cè)定制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，再取1.3制得的樣液2 μL上機(jī)測(cè)定，結(jié)合色譜保留時(shí)間和2對(duì)特征離子對(duì)定性，通過(guò)定量子離子的峰面積計(jì)算樣液中目標(biāo)物的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

表1 15種藥物的質(zhì)譜采集參數(shù)

在電噴霧離子源正離子全掃描（ESI+SCAN） 模式下分別對(duì)15種1 μg/mL質(zhì)量濃度的鎮(zhèn)靜類(lèi)藥物進(jìn)行分析，15種化合物均能形成穩(wěn)定的【M+H】+形式準(zhǔn)分子離子峰。在單離子掃描（SIM）模式下分別優(yōu)化各化合物的裂解電壓（Fragmentor）使各自母離子響應(yīng)值最大，在子離子掃描（Product Ion）模式和多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM） 模式分析中，確定2對(duì)特征離子對(duì)供定性用，其中豐度較高的一對(duì)特征離子對(duì)供定量用，并優(yōu)化其碰撞能（CE）使子離子響應(yīng)值最大。為了保證質(zhì)譜檢測(cè)的靈敏度和重現(xiàn)性，試驗(yàn)采用動(dòng)態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（DMRM）進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，動(dòng)態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式可以根據(jù)不同化合物的保留時(shí)間，分段進(jìn)行MRM掃描，以增加單一目標(biāo)化合物的掃描駐留時(shí)間（Dwell），加大目標(biāo)離子碎片的通量提高數(shù)據(jù)采集效率。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

西替利嗪和羥嗪、氯丙嗪和異丙嗪、氟奮乃靜和奮乃靜具有相同結(jié)構(gòu)的母核，具有相似的二級(jí)質(zhì)譜碎片，準(zhǔn)確定量必須保證在液相色譜上的分離度。研究從儀器損耗、分析時(shí)間和分離效果角度出發(fā)，主要對(duì)比了XBridge C18柱（100 mmL×2.1 mm ID，1.7 μm）、Poroshell 120 EC-C18柱 （100 mmL×2.1 mm ID，2.7 μm）、Cortecs C18柱 （100 mmL×2.1 mm ID，2.7 μm）、Eclipse Plus C18柱 （100 mmL×2.1 mm ID，1.8 μm） 和 Accucore Vanquish C18柱 （100 mmL×2.1 mm ID，1.5 μm） 5種色譜柱。綜合各方面最終選取背壓較低、柱效較高的Poroshell 120 C18柱，實(shí)現(xiàn)了理想的試驗(yàn)效果。

根據(jù)經(jīng)驗(yàn)和文獻(xiàn)資料，在正離子模式下于流動(dòng)相中添加甲酸能增強(qiáng)目標(biāo)化合物的離子化效率使靈敏度提高，試驗(yàn)將甲醇、乙腈、甲酸銨溶液、甲酸溶液進(jìn)行組合，從分離效果和靈敏度考查，選取最佳流動(dòng)相體系。結(jié)果表明，水相中加入甲酸和甲酸銨都可以顯著提升靈敏度，提升效果基本一致，經(jīng)試驗(yàn)選擇添加0.1%甲酸能達(dá)到靈敏度和分離度的最佳效果。乙腈和甲醇相比具有更小的基線(xiàn)噪音和更強(qiáng)的反相洗脫能力，選擇乙腈為有機(jī)相能使梯度淋洗曲線(xiàn)的強(qiáng)度范圍更寬，同時(shí)在乙腈中加入相同的0.1%甲酸使保留時(shí)間更穩(wěn)定。最終確定0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈溶液作為流動(dòng)相，出峰依次為曲吡那敏、地氯雷他定、氯苯那敏、溴苯那敏、阿司咪唑、苯海拉明、異丙嗪、奮乃靜、羥嗪、賽庚啶、西替利嗪、氯雷他定、氟奮乃靜、氯丙嗪、特非那定；豬肝陰性樣品空白色譜圖見(jiàn)圖2，可知該條件下無(wú)干擾。

15種藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流色譜圖見(jiàn)圖1，豬肝陰性樣品空白色譜圖見(jiàn)圖2。

圖1 15種藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流色譜圖

2.3 預(yù)處理方法的優(yōu)化

畜禽肉中富含蛋白質(zhì)、脂肪等，這些物質(zhì)與目標(biāo)化合物被提取液共萃出來(lái)，未經(jīng)合適的凈化處理在離子源會(huì)與目標(biāo)化合物爭(zhēng)奪電子，影響離子化，對(duì)目標(biāo)化合物的電離效率造成抑制或放大，影響定量的準(zhǔn)確性，因此削弱或抵消基質(zhì)效應(yīng)是液質(zhì)分析的主要難點(diǎn)。多種鎮(zhèn)靜類(lèi)藥物之間極性差異較大，為了兼顧特非那定等極性較弱化合物和曲吡那敏等極性較強(qiáng)的化合物的提取率，同時(shí)要盡可能地去除脂肪、蛋白質(zhì)等干擾物，試驗(yàn)考查了不同比例的乙酸乙酯-乙腈溶液作為提取溶劑時(shí)各化合物的提取效率，最終選擇乙酸乙酯∶乙腈（V∶V=20∶80）作為混合提取溶劑能達(dá)到滿(mǎn)意的效果。

圖2 豬肝陰性樣品空白色譜圖

試樣中被溶劑提取出來(lái)的目標(biāo)化合物及其共萃物一般經(jīng)過(guò)合適的SPE小柱能達(dá)到較好的富集和凈化效果，但是除了較高的成本之外，繁瑣的操作步驟不僅影響效率，而且會(huì)造成不穩(wěn)定化合物的損失。試驗(yàn)采用分散固相萃取凈化技術(shù)，常見(jiàn)的吸附劑有PSA，C18，GCB等，PSA主要吸附極性雜質(zhì)，C18作為反相吸附劑適合用來(lái)去除脂肪，GCB主要吸附色素同時(shí)也會(huì)吸附具有平面結(jié)構(gòu)的化合物。試驗(yàn)采用的二乙烯苯/N-乙烯基吡咯烷酮共聚物具有親水親脂的平衡化學(xué)結(jié)構(gòu)，能吸附去除極性范圍更大的干擾物。經(jīng)比較試驗(yàn)考查，1 g的用量能實(shí)現(xiàn)良好的除雜質(zhì)需要，對(duì)于目標(biāo)化合物無(wú)明顯吸附。

由于部分鎮(zhèn)靜類(lèi)藥物具有相同的硫氮雜蒽母核，其環(huán)上硫原子所具有的2對(duì)孤對(duì)電子極易與基質(zhì)中的金屬離子絡(luò)合甚至被儀器金屬管路吸附，造成重現(xiàn)性差、峰形拖尾等現(xiàn)象，EDTA能競(jìng)爭(zhēng)絡(luò)合基質(zhì)中的金屬離子使目標(biāo)化合物被釋放出來(lái)，因此復(fù)溶時(shí)在初始比例流動(dòng)相中加入EDTA（最終濃度為0.1 mol/L）較好解決這個(gè)問(wèn)題。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)的考查

液質(zhì)分析中基質(zhì)效應(yīng)必然存在且無(wú)法完全消除，除了在預(yù)處理過(guò)程中實(shí)現(xiàn)最大效果的凈化，通常采用同位素內(nèi)標(biāo)法、標(biāo)準(zhǔn)加入法、基質(zhì)配標(biāo)法、稀釋法來(lái)削弱和校正基質(zhì)效應(yīng)造成的定量偏差；研究以基質(zhì)效應(yīng)明顯的豬肝為對(duì)象，通過(guò)優(yōu)化梯度洗脫程序，采用基質(zhì)配標(biāo)法較好地解決了基質(zhì)效應(yīng)問(wèn)題。

15種鎮(zhèn)靜類(lèi)藥物的基質(zhì)效應(yīng)研究見(jiàn)表2。

2.5 方法學(xué)研究

2.5.1 線(xiàn)性與靈敏度

按照上述條件將1.4中制得的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液經(jīng)LC-MS/MS分析，以響應(yīng)值為縱坐標(biāo)（Y），以質(zhì)量濃度（ng/mL） 為橫坐標(biāo)（X） 繪制工作曲線(xiàn)，其回歸性系數(shù)R2均大于0.999，表明15種鎮(zhèn)靜類(lèi)藥物在各自質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性良好。以定性子離子的3倍信噪比計(jì)算檢出限（LOD），10倍信噪比計(jì)算定量限（LOQ），可知15種鎮(zhèn)靜類(lèi)藥物L(fēng)OD為1.0～2.0 μg/kg，LOQ 為 2.0～6.0 μg/kg，靈敏度滿(mǎn)足實(shí)際檢測(cè)工作的需要。

表2 15種鎮(zhèn)靜類(lèi)藥物的基質(zhì)效應(yīng)研究/ng·mL-1

15種藥物的線(xiàn)性范圍、線(xiàn)性方程、回歸性系數(shù)、檢出限和定量限見(jiàn)表3。

表3 15種藥物的線(xiàn)性范圍、線(xiàn)性方程、回歸性系數(shù)、檢出限和定量限

2.5.2 準(zhǔn)確度與精密度

在雞肉、豬肝和牛肉基質(zhì)中分別進(jìn)行低、中、高3濃度水平6次回收率試驗(yàn)。

15種藥物的準(zhǔn)確度和精密度（n=6）見(jiàn)表4。

表4 15種藥物的準(zhǔn)確度和精密度（n=6）

由表4可知，回收率為74.1%～88.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.9%～8.5%，該方法具有較好的準(zhǔn)確度和精密度，能滿(mǎn)足實(shí)際檢測(cè)工作的需要。

2.5.3 實(shí)際應(yīng)用

應(yīng)用該方法對(duì)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)與超市市售雞肉50份、牛肉50份、豬肝10份分別進(jìn)行15種鎮(zhèn)靜類(lèi)藥物的測(cè)定，檢出氯丙嗪陽(yáng)性樣品2例，異丙嗪陽(yáng)性樣品1例，奮乃靜陽(yáng)性樣品1例，其余均未檢出。

3 結(jié)論

試驗(yàn)建立了一個(gè)超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）同時(shí)測(cè)定畜禽肉中15種鎮(zhèn)靜類(lèi)藥物殘留的技術(shù)體系。樣品經(jīng)乙腈-乙酸乙酯混合溶液提取，提取液經(jīng)二乙烯苯/N-乙烯基吡咯烷酮共聚物分散固相萃取凈化，反萃濃縮后用動(dòng)態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)方式測(cè)定含量。與目前報(bào)道的文獻(xiàn)與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的方法相比，該方法擴(kuò)大了同類(lèi)型藥物檢測(cè)范圍，適應(yīng)了更廣泛的基質(zhì)，同時(shí)省去了復(fù)雜的前處理，能更快更好地為監(jiān)管部門(mén)的執(zhí)法提供技術(shù)支持，也為同類(lèi)型的檢測(cè)技術(shù)研究提供了借鑒。