肝癌模型小鼠中線粒體源外泌體 基因的差異性表達分析

龍曉芳 李根亮 唐玉蓮 倪安妮 陸瑞群 李曙波 韋海聞 藍丹 陳榮彬

【摘要】 目的 探討線粒體源外泌體基因參與肝細胞癌（HCC）病理過程的可能分子機制。

方法 通過RNA-seq和生物信息學(xué)手段，分析HCC中差異表達的線粒體源外泌體基因（DEMEs）及其生物學(xué)功能。

結(jié)果 HCC組織中共鑒定出93個DEMEs，其中74個表達下調(diào)，19個表達上調(diào)。表達下調(diào)的DEMEs經(jīng)功能富集，共富集到4個生物學(xué)過程（biological process，BP）、4個細胞組分（cellular component，CC）、2個分子活性（molecular function，MF）、1個信號通路（KEGG pathway，KG）和4個蛋白位點序列特征（UP_SEQ_FEATURE，US）。它們參與了氧化還原、脂質(zhì)代謝等過程，且大量DEMEs還具有線粒體轉(zhuǎn)運肽功能。而上調(diào)表達的DEMEs，除了富集到1個CC，即線粒體組分，還發(fā)現(xiàn)其中一些參與了跨膜轉(zhuǎn)運、對過氧化氫和對機械刺激的反應(yīng)過程，有些還具有轉(zhuǎn)移酶活性和ATP結(jié)合能力，并參與癌癥的發(fā)生和轉(zhuǎn)移等病理過程。

結(jié)論 線粒體源外泌體基因在HCC腫瘤組織與非腫瘤組織存在差異性表達，生物信息學(xué)分析顯示這種差異性表達的基因涉及多個生物學(xué)過程，提示它們可能通過多種途徑影響HCC的發(fā)生。

【關(guān)鍵詞】 肝細胞癌;外泌體;線粒體;差異表達基因

中圖分類號：R735.7?? 文獻標(biāo)志碼：A?? DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2020.04.002

Analysis of differential expression of mitochondrion-derived exosomal genes in hepatocellular carcinoma model mice

LONG Xiaofang1，LI Genliang2，TANG Yulian2，NI Anni2，LU Ruiqun2，LI Shubo2，WEI Haiwen1，LAN Dan1，CHEN Rongbin1

（1.Clinical Medicine of Grade 2016，2.Department of Biochemistry and Molecular Cell Biology，Youjiang Medical University for Nationalities，Baise 533000，Guangxi，China）

【Abstract】 Objective To investigate the possible molecular mechanism of mitochondrion-derived exosomal exosome genes（DEMEs） involved in the pathological process of hepatocellular carcinoma（HCC）.

Methods The?? DEMEs in HCC and their biological functions were analyzed by RNA-seq and bioinformatics methods.

Results 93 DEMEs were identified in HCC，among which 74 were down-regulated and 19 were upregulated.The down-regulated DEMEs were functionally enriched to 4 biological processes（BPs），4 cellular components （CCs），2 molecular functions （MFs），1 signal pathway （KG） and 4 UP-Seq features （USs）.They involved in redox and lipid metabolism and majority of DEMEs had mitochondrial transport peptide-encoding sequences.The up-regulated DEMEs，in addition to the enrichment of 1 CC，i.e.mitochondrial component，were also found to be involved in the transmembrane transport，the reaction to hydrogen peroxide and mechanical stimulation，some of them also had transferase activity and the? ATP binding ability，and involved in the occurrence and metastasis of cancer and other pathological processes.

Conclusion Mitochondrion-derived exosomal genes are differentially expressed in HCC tumor and non-tumor tissues.Bioinformatics analysis shows that the DEMEs are involved many biological processes，suggesting that they may affect the development of HCC in various ways.

【Key words】 HCC;exosomes;mitochondria;differentially expressed genes

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全世界高發(fā)的癌癥之一。據(jù)報道，2018年全球HCC新發(fā)病例約84.2萬人，死亡病例78.2萬人[1]。外泌體是細胞分泌的小囊泡，在人體生理病理過程中發(fā)揮著重要作用，廣泛參與細胞間通訊、血管再生、細胞遷移、免疫應(yīng)答及腫瘤的發(fā)生發(fā)展[2～5]。來自腫瘤細胞的外泌體能將來源于母體腫瘤細胞的信息傳遞給正常細胞或惡性細胞[6]。線粒體是細胞能量代謝的中心，線粒體功能障礙與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[7～9]。但線粒體源外泌體基因通過何種機制參與HCC的發(fā)展這一問題還有待進一步研究。本文旨在通過分析HCC腫瘤組織和非腫瘤組織中差異表達的線粒體源外泌體基因（differentially expressed mitochondrion-derived exosomal genes，DEMEs），探討其參與HCC發(fā)展的可能分子機制，為臨床治療提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和方法

肝癌腫瘤組織取自本實驗室構(gòu)建的肝癌模型小鼠（n=40）。肝癌模型小鼠構(gòu)建方法如下：選取40只鼠齡7周左右、體重25 g左右的健康昆明小鼠于雙前肢腋下一次性注射H22肝癌細胞株（濃度=10 5個細胞/mL），每只注射0.2 mL，正常飼養(yǎng)1個月后，成瘤小鼠即為肝癌模型小鼠，取其腫瘤組織為腫瘤樣本組織。同法，取另40只健康小鼠無菌生理鹽水注射（0.2 mL/只）作為對照組，取健康肝組織對照。取同組內(nèi)樣本組織等量混合約50 g，提取總RNA（Eastep Super總RNA提取試劑盒，中國上海），送公司進行測序分析。RNA-seq質(zhì)量檢測及clean reads篩選按常規(guī)程序完成[10]。

1.2 DEMEs的篩選

分析RNA-seq數(shù)據(jù)，篩選HCC腫瘤組織和非腫瘤肝組織之間的差異表達基因，差異表達基因篩選以RPKM（Reads Per Kilo bases per Million reads，每百萬測序堿基中每千個轉(zhuǎn)錄子測序堿基中所包含的測序片斷數(shù)）比值≥2或≤0.5為有統(tǒng)計學(xué)意義。而后以“癌癥（cancer or carcinoma）、外泌體（exosome or exosomal）及線粒體（mitochondria or mitochondrial）”為關(guān)鍵詞，在NCBI中的Nucleotide數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp）進行檢索，獲得癌癥線粒體源外泌體基因作為背景基因。將背景基因與RNA-seq數(shù)據(jù)中的差異表達基因進行比對，獲得DEMEs。

1.3 DEMEs的功能分析

利用DAVID 6.8在線軟件（https：//david.ncifcrf.gov/）對DEMEs進行功能富集分析，并對富集到的生物學(xué)程序（biological process，BP）、細胞組分（cellular component，CC）、分子活性（molecular function，MF）、信號通路（KEGG pathway，KG）、蛋白位點序列特征（UP_SEQ_FEATURE，US）和功能部位（Interpro）等進行功能注釋聚類，以FDR值（false discovery rate，錯誤發(fā)現(xiàn)率）≤0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.4 DEMEs編碼蛋白的互作分析

通過STRING11.0版本軟件（https：//string-db.org/）在線對DEMEs編碼蛋白進行互作分析，以評價其在分布和功能上的相關(guān)性。

2 結(jié)? 果

2.1 測序數(shù)據(jù)

肝癌腫瘤組織和非腫瘤肝組織樣本通過RNA-seq分別獲得了5.86 G base（39.99 M clean reads）和6.35 G base （43.33 M clean reads）的測序數(shù)據(jù)。二者的Q30分別為93.62%和93.62%，表明堿基測序錯誤率小于0.1%，測序數(shù)據(jù)質(zhì)量好，測序的覆蓋度和深度較高，可用于后續(xù)分析使用。經(jīng)過分析，在兩樣本之間共發(fā)現(xiàn)4483個差異表達基因。

2.2 DEMEs篩選

在NCBI數(shù)據(jù)庫中共獲得了5435個癌癥相關(guān)線粒體源外泌體基因。與測序數(shù)據(jù)中的4483個差異表達基因比對，共篩選出93個DEMEs，其中表達上調(diào)的19個（見表1），表達下調(diào)的74個（見表2）。

2.3 DEMEs的生物學(xué)功能

對篩選出的DEMEs通過DAVID 6.8軟件進行了功能富集。其中，在HCC中下調(diào)表達的74個DEMEs共富集到4個BP、4個CC、2個MF、1個KG和4個US（圖1）。從BP可以看出，24個基因參與了氧化還原過程，16個基因參與了脂類代謝過程等。從MF可以看出，這些分子具有氧化還原酶活性和催化活性等。且表達下調(diào)的這74個DEMEs中，73個屬于線粒體組分，且其中31個具有線粒體轉(zhuǎn)運肽功能。而表達上調(diào)的DEMEs，僅富集到了1個CC，即線粒體組分（見圖1）。另外，上調(diào)表達的DEMEs中，SFXN3、SLC25A24和SLC25A4 三個基因參與了跨膜轉(zhuǎn)運;SRC和MMP2兩個基因參與了對過氧化氫及對機械刺激的反應(yīng);RIPK3、ALDH18A1、OXCT1、PDSS1、AGPS和SRC等6個基因還具有轉(zhuǎn)移酶活性;RIPK3、SPATA5、ALDH18A1、RAD51、SRC等5個基因具有ATP結(jié)合能力。DEMEs編碼蛋白的互作關(guān)系見圖2。

3 討? 論

外泌體是包涵蛋白質(zhì)、RNA和miRNA等多種物質(zhì)的胞外膜囊細胞器。外泌體內(nèi)容物并不是由細胞隨機裝配而分泌到細胞外環(huán)境中，而是受到細胞的精細調(diào)節(jié)，其內(nèi)容物反映了來源細胞的功能，并參與細胞間的各種信息傳遞及物質(zhì)交換[11]。線粒體是細胞能量代謝的中心，與腫瘤的發(fā)生、生長、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[7]。而外泌體攜帶的線粒體相關(guān)基因則可能會影響靶標(biāo)組織細胞的能量代謝。

本研究通過RNA-seq和生物信息學(xué)手段及數(shù)據(jù)庫檢索，在HCC組織中共鑒定出93個DEMEs，其中74個基因表達下調(diào)，19個基因表達上調(diào)。這些DEMEs的功能也主要富集于下調(diào)表達基因中。這一結(jié)果也得到了這些基因編碼蛋白互作關(guān)系的驗證。這些功能包括氧化還原過程、脂質(zhì)代謝過程、氧化還原酶活性、催化活性等。尤其值得一提的是，在下調(diào)表達的DEMEs中，有31個基因具有線粒體轉(zhuǎn)運肽功能。這些結(jié)果表明，HCC組織中外泌體攜帶的線粒體相關(guān)基因有顯著減少的趨勢，且這些減少的基因參與了重要的能量代謝過程。也就是說，線粒體源外泌體基因在正常組織中可能通過外泌體的運輸，以轉(zhuǎn)運肽介導(dǎo)的方式定位于新靶標(biāo)細胞的線粒體膜上，從而參與有氧呼吸過程的能量代謝。由于癌細胞的能量代謝主要是通過無氧呼吸提供的[12]，因此DEMEs在HCC中的減少可能有利于癌組織的無氧呼吸，從而有利于癌細胞的生存。但是，HCC中DEMEs的減少是癌變的結(jié)果，還是癌變的原因，這還有待進一步研究。無論是癌變的結(jié)果還是原因，都為我們提示了一條抑制癌細胞增殖的可能新途徑，即通過外泌體途徑增加癌組織中的DEMEs，從而促進HCC組織中的有氧呼吸，來抑制HCC細胞的增殖。

而上調(diào)表達的DEMEs除了富集到1個CC即線粒體組分外，沒有富集到其他功能，表明上調(diào)表達的DEMEs對HCC的能量代謝影響較小。但是，上調(diào)表達的基因還參與跨膜轉(zhuǎn)運、對過氧化氫和對機械刺激的反應(yīng)，有些還具有轉(zhuǎn)移酶活性和ATP結(jié)合能力。其中，ALDH5A1不僅與非小細胞肺癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和預(yù)后相關(guān)[13]，還與卵巢癌細胞的增殖、遷移、轉(zhuǎn)移相關(guān)[14]。還有MMP2是Ⅳ型膠原酶，參與血管系統(tǒng)重塑、血管生成、組織修復(fù)、腫瘤浸潤、炎癥及動脈粥樣硬化斑塊破裂等多種功能，除降解細胞外基質(zhì)蛋白外，還可以作用于多種非基質(zhì)蛋白，例如大內(nèi)皮1和促進血管收縮的Β型CGRP。此外，有報道稱MMP2還能通過調(diào)節(jié)GSK3β的活性促進心肌氧化應(yīng)激，參與心肌細胞死亡途徑。這些結(jié)果表明，上調(diào)表達的DEMEs在HCC中可能具有利用ATP參與跨膜轉(zhuǎn)運及參與對過氧化氫和對機械刺激反應(yīng)的生理功能，進而影響癌癥的發(fā)生、發(fā)展和遷移。該現(xiàn)象也為我們提示了另一條抑制癌細胞增殖的可能新途徑，即通過抑制利用ATP參與跨膜轉(zhuǎn)運、參與對過氧化氫和對機械刺激反應(yīng)相關(guān)的DEMEs，來抑制HCC細胞的活性。

綜上所述，我們的結(jié)果顯示線粒體源外泌體基因在HCC腫瘤組織與非腫瘤組織存在差異性表達，生物信息學(xué)分析顯示這種差異性表達的基因涉及多個生物學(xué)過程，提示它們可能通過多種方式影響HCC的發(fā)生。在HCC中，差異表達的線粒體源外泌體基因可能主要是通過減弱HCC組織中的有氧呼吸和增強利用ATP參與跨膜轉(zhuǎn)運、對過氧化氫和對機械刺激反應(yīng)，來影響癌癥的病理過程。研究結(jié)果為我們提示了2條可能抑制癌細胞增殖的新途徑，即通過外泌體途徑增加癌組織中有氧呼吸相關(guān)的DEMEs，或抑制利用ATP參與跨膜轉(zhuǎn)運、參與對過氧化氫和對機械刺激反應(yīng)相關(guān)的DEMEs，來促進HCC組織中的有氧呼吸和抑制HCC細胞的活性。今后，我們將持續(xù)探討這2條抑制癌細胞增殖的可能新途徑，以期對其作用機制有更深入的了解，為臨床肝癌的治療和預(yù)防提供更可靠的理論依據(jù)。另外對于本實驗獲得的差異性表達基因沒有提供qPCR驗證分析，可能是本研究的一個缺陷，由于我們此次實驗的實驗樣本與本實驗室前期的一項研究[10]所用樣本為同一批次樣本，測序數(shù)據(jù)相同，前期的實驗已經(jīng)對測序數(shù)據(jù)進行了qPCR驗證，驗證了測序結(jié)果與qPCR結(jié)果是一致的。故此次實驗未對差異表達基因進行驗證分析。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2019-12-02 修回日期：2020-02-14）

（編輯：潘明志）

基金項目：廣西大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（201810599096）;2020年廣西學(xué)位與研究生教育改革課題（JGY2020164）;廣西自然科學(xué)基金（2016GXNSFAA380177，2015GXNSFAA139219）

作者簡介：龍曉芳，女，在讀本科生。E-mail：437443986@qq.com

通信作者：李根亮。E-mail：ligenliang@163.com

[本文引用格式]龍曉芳，李根亮，唐玉蓮，等.肝癌模型小鼠中線粒體源外泌體基因的差異性表達分析[J].右江醫(yī)學(xué)，2020，48（4）：246-251.