白背葉總黃酮對(duì)HSC-T6細(xì)胞增殖作用及膠原蛋白和細(xì)胞因子的影響

謝穩(wěn) 嚴(yán)建業(yè)

【摘要】 目的 觀察白背葉總黃酮體外對(duì)肝星狀細(xì)胞（HSC-T6）增殖的抑制作用和相關(guān)膠原蛋白、細(xì)胞因子的影響。

方法 體外培養(yǎng)HSC-T6細(xì)胞，將白背葉總黃酮（終濃度為200、100、50、25、12.5 μg/mL）作用于細(xì)胞48 h后，以MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率，計(jì)算IC50;利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況;收集細(xì)胞上清液，用ELISA法分別檢測(cè)膠原蛋白COL-Ⅰ、COL-Ⅲ的表達(dá)水平和細(xì)胞因子TGF-β1、PDGF-BB的含量。

結(jié)果 白背葉總黃酮能通過誘導(dǎo)HSC-T6凋亡而抑制HSC-T6細(xì)胞的增殖，其抑制作用與藥物終濃度呈量效關(guān)系;并顯著降低HSC-T6 細(xì)胞生成的膠原蛋白COL-Ⅰ、COL-Ⅲ和細(xì)胞因子TGF-β1、PDGF-BB含量，與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或0.01）。

結(jié)論 白背葉總黃酮體外對(duì)HSC-T6細(xì)胞增殖有顯著抑制作用，可治療肝纖維化。

【關(guān)鍵詞】 白背葉總黃酮;HSC-T6;膠原蛋白;細(xì)胞因子

中圖分類號(hào)：R285.5?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?? DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2020.04.003

Effects of total flavonoids from Mallotus Apelta on proliferation of HSC-T6 cells and on collagen and cytokines

XIE Wen YAN Jianye

（1.School of Pharmacy，Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410208，Hunan，China;2.Science and

Technology Innovation Center，Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410208，Hunan，China;

3.Department of Pharmacy，Yongzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine，Yongzhou 425000，Hunan，China）

【Abstract】 Objective To observe the inhibitory effect of total flavonoids from Mallotus Apelta on the proliferation of hepatic stellate cells （HSC-T6） and the effects of related collagen and cytokines.

Methods HSC-T6 cells were cultured in vitro，and after the total flavonoids（final concentrations were 200，100，50，25，12.5 μg/mL） were applied to the cells for 48 h，MTT assay was used to detect the cell survival rate and calculate IC50.Flow cytometry was used to detect apoptosis.In addition，cell supernatants were collected and the expression levels of collagen COL-Ⅰ and COL-Ⅲ and the contents of cytokines TGF-β1 and PDGF-BB were detected by ELISA.

Results Total flavonoids of Mallotus Apelta can inhibit the proliferation of HSC-T6 cells by inducing apoptosis of HSC-T6 cells，and the inhibitory effect was in a dose-effect relationship with the final drug concentration.The contents of collagen COL-Ⅰ，COL-Ⅲ and cytokines TGF-β1，PDGF-BB produced by HSC-T6 cells were significantly reduced，which was statistically significant compared with the blank control group（P<0.05 or 0.01）.

Conclusion Total flavonoids of Mallotus Apelta has significant inhibitory effect on proliferation of HSC-T6 cells in vitro and can be used to treat liver fibrosis.

【Key words】 total flavonoids of Mallotus Apelta;HSC-T6;collagen;cytokines

白背葉又名白鶴葉、白面戟、白面風(fēng)、白桃葉、白膜樹，為大戟科野桐屬植物白背葉[Mallotusapelta（Lour.）Muell.-Arg]的干燥葉，廣泛分布于廣西、廣東、湖南、海南、浙江等地。有柔肝活血、健脾化濕、收斂固脫、消炎止血等功效，常用于治療各種慢性肝炎、肝脾腫大、子宮脫垂脫肛、妊娠水腫、耳炎、癤腫、跌打損傷、外傷出血癥[1]。藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，白背葉具有抗腫瘤[2]、抗肝纖維化[3～4]、抗菌抗乙肝病毒[5～6]、抗炎[7]等作用。白背葉的根或葉在治療肝纖維化方面已有相關(guān)研究，但白背葉黃酮類成分的抗肝纖維化作用鮮見報(bào)道，故本研究以白背葉總黃酮為研究對(duì)象，從細(xì)胞水平觀察其對(duì)肝星狀細(xì)胞（HSC-T6）增殖的作用，探討白背葉治療肝纖維作用的研究機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物

白背葉總黃酮，白背葉采自廣西南寧老虎嶺，將500 g葉干燥剪碎，加入10倍量純水，加熱提取2 h，趁熱過濾收集濾液。濾渣以相同方法繼續(xù)提取2 h，最后合并濾液，將濾液過大孔吸附樹脂柱，以水洗脫，再用乙醇洗脫，收集與鹽酸-鎂粉溶液產(chǎn)生陽性反應(yīng)的洗脫液，收集的洗脫液通過減壓干燥，重結(jié)晶即得到總黃酮。

1.2 試劑

DMEM培養(yǎng)基（HyClone，批號(hào)：ABA212570），胎牛血清（杭州四季青，批號(hào)：18090505），胰蛋白酶（Solarbio，批號(hào)：801S042），秋水仙堿（Sigma，批號(hào)：201708），Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（凱基生物，批號(hào)：20190821），COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、TGF-β、PDGF-BB ELISA試劑盒（Bio-Swamp公司，批號(hào)：201705）。

1.3 儀器

流式細(xì)胞檢測(cè)儀器（美國ThermoFisher，型號(hào)：Altune Nxt）;倒置顯微鏡（LEICA DMIRB）;二氧化碳培養(yǎng)箱（ThermoFisher）;超凈工作臺(tái)（荷蘭ClearAir公司）;低速離心機(jī)（德國Biofuge Stoctos 公司）;連續(xù)波長酶標(biāo)儀（瑞士TECAN，型號(hào)：infinite M200pro）

1.4 MTT法檢測(cè)HSC-T6的增殖

對(duì)數(shù)生長期HSC-T6細(xì)胞消化離心后，用10%血清的DMEM培養(yǎng)基調(diào)成濃度0.5×105 cell/mL混懸液接種于96孔板，每孔100 μL，使細(xì)胞數(shù)為5000個(gè)/孔，將細(xì)胞分為正常對(duì)照組、陽性對(duì)照組（秋水仙堿）、白背葉總黃酮（5個(gè)濃度梯度），每組3個(gè)復(fù)孔，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞貼壁后，正常對(duì)照組加100 μL培養(yǎng)基，其余各組加相應(yīng)的藥物100 μL，使秋水仙堿終濃度為1 μg/mL，白背葉總黃酮終濃度分別為200、100、50、25、12.5 μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔加入10 μL MTT溶液（5 mg/mL），4 h后棄上清，加入150 μL DMSO，振蕩10 min，以酶標(biāo)儀在490 nm處測(cè)各孔吸光度值（OD），計(jì)算抑制率，再根據(jù)抑制率求出半數(shù)抑制濃度（IC50），抑制率計(jì)算公式：腫瘤細(xì)胞生長抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組平均OD值/對(duì)照組平均OD值）×100%。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HSC-T6細(xì)胞的凋亡

按上述方法消化離心細(xì)胞后，將細(xì)胞濃度調(diào)成1×105 個(gè)/mL，接種于6孔板中，每孔1 mL。設(shè)正常對(duì)照組、陽性對(duì)照組（秋水仙堿，終濃度為1 μg/mL）及白背葉總黃酮高、中、低濃度組（終濃度為40、20、10 μg/mL），每組3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，將上清液去掉后，正常對(duì)照組加DMEM 完全培養(yǎng)液，藥物組加入對(duì)應(yīng)的藥物，均為1 mL，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。各組細(xì)胞用不含EDTA胰酶消化離心后，按試劑盒方法及要求進(jìn)行染色，用流式細(xì)胞檢測(cè)儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.6 ELISA法檢測(cè)HSC-T6細(xì)胞COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、TGF-β1、PDGF-BB的含量

按上述方法消化離心細(xì)胞后，將細(xì)胞調(diào)成0.5×105 cell/mL混懸液接種于96孔板，每孔100 μL，使孔內(nèi)細(xì)胞數(shù)為5000個(gè)。將細(xì)胞分為正常對(duì)照組、陽性對(duì)照組（秋水仙堿 1 μg/mL）、白背葉總黃酮高、中、低濃度組（終濃度為40、20、10 μg/mL），每組3個(gè)復(fù)孔，置于37℃，5%濃度CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞貼壁后，除正常對(duì)照組加培養(yǎng)基，其余各組加相應(yīng)的藥物，均為100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后取細(xì)胞上清，按ELISA試劑盒方法測(cè)定COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、TGF-β1、PDGF-BB濃度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，若方差齊性，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間均數(shù)比較用LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)? 果

2.1 對(duì)HSC-T6細(xì)胞增殖作用的影響

與正常對(duì)照組比較，秋水仙堿陽性藥OD值明顯降低（抑制率明顯升高），兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），提示本次實(shí)驗(yàn)研究是成功的;而白背葉總黃酮?jiǎng)┝拷M的OD 值也明顯降低，呈一定程度的量效關(guān)系，各個(gè)劑量組與正常對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或0.001）。根據(jù)各組抑制率求出IC50為84.5 μg/mL，根據(jù)IC50結(jié)果定出40、20、10 μg/mL 3個(gè)濃度進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。見表1。

2.2 對(duì)HSC-T6細(xì)胞凋亡的影響

白背葉總黃酮40、20、10 μg/mL三個(gè)濃度下細(xì)胞早期凋亡率分別為19.62%、13.67%、7.80%，晚期凋亡率分別為44.10%、16.24%、11.21%，說明白背葉總黃酮對(duì)HSC-T6細(xì)胞增殖的抑制主要是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且均以晚期凋亡為主，細(xì)胞凋亡率與藥物濃度呈正相關(guān)。見表2、圖1。

2.3 對(duì)HSC-T6細(xì)胞COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、TGF-β1、PDGF-BB分泌的影響

與正常對(duì)照組比較，陽性藥秋水仙堿組的COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、TGF-β1、PDGF-BB數(shù)值明顯下降，除COL-Ⅰ數(shù)值外，COL-Ⅲ、TGF-β1、PDGF-BB數(shù)值與正常對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。白背葉總黃酮40 μg/mL濃度作用下，能顯著減少膠原COL-Ⅲ、TGF-β1、PDGF-BB的含量，與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;白背葉總黃酮20 μg/mL濃度作用下，對(duì)TGF-β1有顯著抑制作用，與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;白背葉總黃酮10 μg/mL濃度作用下，對(duì)COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、TGF-β1、PDGF-BB生成均無顯著抑制作用，與正常對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表3。

3 討? 論

肝纖維化是多種肝臟疾病共有的病理生理過程。當(dāng)肝臟受到損傷時(shí)，可導(dǎo)致肝纖維化細(xì)胞（HSC）由靜息狀態(tài)轉(zhuǎn)為活化并增殖，繼而導(dǎo)致肝組織細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）過度產(chǎn)生和沉積。隨著肝臟纖維化程度加重，會(huì)由肝纖維化不可逆演變成肝硬化、肝癌。因此，在抗肝纖維化藥物研究過程中，抑制HSC細(xì)胞的活化與增生已成為重要環(huán)節(jié)。

ECM 的主要成分以膠原蛋白為主，同時(shí)還有非膠原糖蛋白、蛋白多糖及彈性蛋白等。而膠原蛋白以Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原為主，其中Ⅰ型膠原占膠原總量的60%～70%，Ⅲ型占20%～30%，因此Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)水平可作為判斷ECM的重要指標(biāo)[8];血小板轉(zhuǎn)化因子（PDGF）是由A、B兩條多肽鏈組成的二聚體結(jié)構(gòu)，存在AA、BB和AB 3種形式。其中PDGF-BB在促進(jìn)HSC活化增殖作用最強(qiáng)[9]。當(dāng)肝細(xì)胞受到損傷時(shí)，肝細(xì)胞釋放過量PDGF，其會(huì)通過與HSC膜上特異性受體相結(jié)合，相應(yīng)的信號(hào)因子被激活參與免疫應(yīng)答，HSC發(fā)生有絲分裂，最終使ECM發(fā)生過度沉積，而致纖維化的發(fā)生;轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）是目前公認(rèn)最重要的致肝纖維化細(xì)胞因子[10]，肝臟在正常情況下TGF-β1的表達(dá)極少，而肝損傷時(shí)其表達(dá)顯著增加，進(jìn)而使介導(dǎo)細(xì)胞增殖或細(xì)胞外基質(zhì)生成的信號(hào)通路如Smads和p38/MAPK等通路打亂，促使HSC細(xì)胞大量增殖產(chǎn)生促纖維化作用，是肝纖維化形成的關(guān)鍵因子[11]。

本研究主要以大鼠肝星狀細(xì)胞即HSC-T6細(xì)胞為模型，觀察白背葉總黃酮抑制肝纖維細(xì)胞增殖的作用。結(jié)果提示，白背葉總黃酮通過誘導(dǎo)HSC-T6細(xì)胞凋亡而抑制其增殖，同時(shí)顯著降低膠原蛋白COL-Ⅲ的表達(dá)水平及細(xì)胞因子TGF-β1、PDGF-BB的含量。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2020-03-06 修回日期：2020-04-03）

（編輯：梁明佩）

基金項(xiàng)目：長沙市科技計(jì)劃項(xiàng)目（kq1701070）

作者簡介：謝穩(wěn)，男，主管藥師，醫(yī)學(xué)學(xué)士，研究方向：中藥制劑及質(zhì)量控制。E-mail：414903961@qq.com

通信作者：嚴(yán)建業(yè)。E-mail：yanjianye201@126.com

[本文引用格式]謝穩(wěn)，嚴(yán)建業(yè).白背葉總黃酮對(duì)HSC-T6細(xì)胞增殖作用及膠原蛋白和細(xì)胞因子的影響[J].右江醫(yī)學(xué)，2020，48（4）：252-256.