無創產前檢測篩查拷貝數變異的臨床應用價值探討

謝潤桂 魏順娣 何曉旋 江建榮 何怡

【摘要】 目的 探討無創產前檢測（NIPT）篩查拷貝數變異（CNVs）的臨床應用價值。

方法 選擇2017年5月至2019年10月，因NIPT發現染色體結構變異而選擇產前診斷的孕婦共52例，利用G顯帶核型分析及微陣列式基因芯片雜交法（CMA）對羊水細胞進行檢測，并比較三種方法的檢測結果，計算陽性預測值。

結果 52例羊水CMA檢測結果證實CNVs 25例，其中與NIPT結果符合致病性CNVs 15例;與NIPT結果符合臨床意義不明確CNVs 7例;與NIPT結果符合良性CNVs 3例。NIPT檢測CNVs陽性預測值為48.1%（25/52）。13例NIPT提示CNVs片段<5 Mb的樣本中有10例與CMA結果相符，其中3例異常位于引起微缺失/微重復綜合征（MDs）的區域，另外39例CNVs片段≥5 Mb的樣本中有15例與CMA結果相符。MDs區域的CNVs占致病性CNVs的5/15（33.3%），其中有3例片段<5 Mb（60.0%），位于MDs區域的CNVs片段的陽性預測值為5/8（62.5%）。夫妻雙方備用血驗證結果顯示：致病性CNVs親本來源占4/15，臨床意義不明確CNVs為親本來源占4/7。隨訪發現 CMA 結果正常、良性的 CNVs和臨床意義不明確 CNVs 孕婦均選擇繼續妊娠，產后隨訪均未發現新生兒表型異常; 致病性CNVs 孕婦大多選擇終止妊娠，1例位于MDs 區域的CNVs胎兒出生后出現表型異常。

結論 NIPT用于篩查CNVs具有較高陽性預測值，能夠檢測出各種類型的CNVs，特別是染色體MDs區域的CNVs，具有良好的臨床應用前景。同時，該技術仍存在一定的假陽性，應進一步結合其他產前診斷方法做出準確診斷。

【關鍵詞】 無創產前檢測;拷貝數變異;微陣列式基因芯片雜交法;微缺失/微重復綜合征

中圖分類號：R714.5?? 文獻標志碼：A?? DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2020.04.006

Discussion on the clinical value of noninvasive prenatal screening for copy number variation

XIE Rungui，WEI Shundi，HE Xiaoxuan，JIANG Jianrong，HE Yi

（Center of Prenatal Diagnosis，Dongguan Maternal and Child Health Hospital，Dongguan 523107，Guangdong，China）

【Abstract】 Objective To explore the clinical value of noninvasive prenatal testing（NIPT） in screening for copy number variations（CNVs）.

Methods From May 2017 to October 2019，52 pregnant women were selected for prenatal diagnosis because of chromosomal structural variations found in NIPT.Amniotic fluid cells were detected by g-banding karyotype analysis and CMA，and the test results of the three methods were compared to calculate the positive predictive value.

Results Results of 52 cases of amniotic fluid CMA confirmed CNVs in 25 cases，including 15 cases of pathogenic CNVs，which was consistent with NIPT result.Variants of unknown significance was 7 cases，which was consistent with NIPT result.3 cases of benign CNVs was consistent with NIPT results.The positive predictive value of CNVs detected by NIPT was 48.1%（25/52）.13 cases of NIPT suggested that 10 of the samples <5 Mb of the CNVs fragment were consistent with the CMA results，3 of which were abnormal in the region causing microdeletion /microrepetition syndromes（MDs）.In addition，15 of the samples≥5 Mb of the CNVs fragment in 39 cases were consistent with the CMA results.CNVs in the MDs region accounted for 5/15（33.3%） of the pathogenic CNVs，including 3 fragments<5 Mb（60.0%），and the positive predictive value of CNVs fragments located in the MDs region was 5/8（62.5%）.The verification results of blood reserve of husband and wife showed that the source of pathogenic CNVs accounted for 4/15 of the parents，variants of unknown significance accounted for 4/7 of the parents.Follow-up revealed that pregnant women with normal CMA results，benign CNVs and unclear clinical significance CNVs all chose to continue their pregnancy，and no phenotypic abnormality was found in postpartum follow-up.Most of the pregnant women with pathogenic CNVs chose to terminate their pregnancy.One pathogenic CNVs fetus located in the MDs region showed phenotypic abnormalities after birth.

Conclusion NIPT has a high positive predictive value for screening CNVs，and can detect many types of CNVs，especially CNVs in the chromosomal MDs region，which has a good clinical application prospect.At the same time，there are still some false positives in this technique，which should be further combined with other prenatal diagnosis methods to make an accurate diagnosis.

【Key words】 noninvasive prenatal testing;copy number variations;microarray gene chip hybridization;microdeletion/microduplication syndrome

基于游離DNA的無創產前檢測（noninvasive prenatal testing，NIPT）是利用大規模平行測序技術（massively parallel sequencing，MPS）對包含母體及胎盤來源的所有游離DNA片段進行深度測序，并利用生物信息分析技術確定游離DNA片段的來源，再與正常的參比樣本比較，然后獲得每條染色體各個位置相對的劑量信息，從而判斷染色體是否異常。目前，NIPT已廣泛用于13三體、18三體和21三體的產前篩查，并擴展應用到性染色體非整倍體和部分拷貝數變異（Copy numbervariations，CNVs）的篩查[1～2]。不同于整條性染色體數目增加或者減少的性染色體非整倍體，CNVs一般指染色體長度為大于1 kb的DNA片段的缺失、插入、重復，屬于染色體上超微結構的失衡。NIPT檢測性染色體非整體和CNVs的陽性率及陽性預測值均較高，一些研究已證實NIPT確實能夠發現CNVs[3]。傳統的細胞遺傳學分析難以發現CNVs，常見檢測CNVs的方法有Fish、QF-PCR和微陣列式基因芯片雜交法（CMA），其中致病性CNVs 可導致具有復雜臨床表現的胎兒微缺失/微重復綜合征（MDs）[4]。絕大多數MDs在宮內發育期間基本無異常表現（宮內發育遲緩、羊水過多/過少、特征性的臟器畸形是部分微缺失綜合征的唯一表現）;缺乏有力的產前篩查指標或方法是目前最困難的挑戰[5]。目前CNVs檢測多用于新生兒發育遲緩、智力低下患者，在產前診斷的應用尚缺乏有力證據。本研究對NIPT產前篩查CNVs的臨床應用價值進行探討，現報告如下。

1 對象與方法

1.1 對象

選擇2017年5月至2019年10月，因NIPT發現CNVs陽性而選擇在我院產前診斷的孕婦共52例，年齡21～42 歲，中位年齡31.5歲，NIPT平均孕周18.2周。NIPT排除有以下既往史病例：1年內異體輸血史、1年內移植手術史（胚胎移植手術除外）、4周內免疫治療史和干細胞治療史。對入選孕婦進行遺傳咨詢，建議羊膜腔（18～22周）穿刺術取樣進行產前診斷，穿刺平均孕周20.6周，行G顯帶核型分析及CMA檢測。本研究經東莞市婦幼保健院倫理委員會批準，所有參加孕婦簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 NIPT檢測方法

樣本采集孕婦靜脈血7～10 mL，使用CellFree DNA BCT 管，采血后顛倒混勻8～10次，24小時內進行血漿分離。首先將血樣在4℃下以1600×g離心10分鐘，以使血漿與外周血細胞分離。將血漿部分小心地轉移到聚丙烯管中，并在4℃下以16 000×g離心10分鐘，以沉淀剩余的細胞。基因組DNA提取、測序文庫構建和質量控制用試劑盒（S10020，Capital genomics）提取基因組DNA，測定基因組DNA濃度，然后在-20℃保存。根據晶芯胎兒染色體非整倍體T21、T18、T13檢測試劑盒（CFDA注冊許可證第0153400300號）的說明書進行文庫構建、質量控制和匯集。使用晶芯Bioelectron Seq 4000系統（CFDA注冊許可號20153400309）半導體測序儀進行DNA測序，測序讀數被過濾并與人類參考基因組（HG19）比對。

1.2.2 染色體核型分析方法

羊水經細胞培養后，用秋水仙素處理，根據低滲、固定、滴片、烤片、消化和G顯帶步驟，完成制片，采用LEICA GSL-120全自動染色體掃描儀獲得染色體中期分裂象，核型分析和命名按照人類細胞遺傳學命名國際體制進行。

1.2.3 CMA檢測方法

抽取孕婦羊水，并采集夫妻雙方外周血備用。若發現臨床不明確的CNVs或者致病性CNVs則對父母備用血進行CMA檢測，以判斷CNVs來源和性質。運用美國Affymetrix公司的CytoScan HD探針檢測，按照廠家的標準操作說明書進行操作，主要步驟包括： DNA提取、酶切、連接、PCR、PCR產物鑒定、PCR產物純化、定量、片段化、片段化的QC質量控制、標記、雜交、洗滌、染色、掃描和數據分析。根據CNVs出現的位置、片段大小、缺失或重復，是否含有OMIM基因、是否已有文獻明確致病臨床意義，是否大于3 Mb，是否為親本來源等情況進行判斷，參照DECPHER、OMIM、UCSCR等數據庫進行結果判讀。根據美國ACMG指南[5]分為：良性CNVs （benign CNVs）、臨床意義不明確的CNVs （variants of unknown significance VOUS）、 致病性CNVs （pathogenic CNVs）。

1.2.4 隨訪

52例孕婦在分娩前后1個月由專職護士進行兩次電話隨訪，分別隨訪孕期胎兒發育情況、妊娠結局和新生兒表型情況。

2 結? 果

2.1 NIPT 結果

52例CNVs樣本的片段大小：13例CNVs<5 Mb，39例CNVs≥5 Mb，CNVs樣本提示異常類型：重復22例，缺失24例，同時存在缺失和重復6例。8例在位于MDs區域的CNVs中有6例片段小于5 Mb，見表1。

2.2 染色體核型分析和CMA 檢測結果

52例病例的介入性產前診斷結果：羊水核型正常44例，異常8例，異常核型結果均與NIPT提示的CNVs相符，且片段均大于5 Mb，并位于非MDs區域。羊水CMA檢測結果證實CNVs 25例，其中與NIPT結果符合致病性CNVs 15例;與NIPT結果符合臨床意義不明確CNVs 7例;與NIPT結果符合良性CNVs 3例。NIPT檢測CNVs陽性預測值為48.1%（25/52），25例CMA檢測提示CNVs病例的介入性產前診斷結果見表2。13例NIPT提示CNVs片段<5 Mb的樣本中有10例與CMA結果相符，其中3例異常位于引起MDs的區域，另外39例CNVs片段≥5 Mb的樣本中有15例與CMA結果相符。MDs區域的CNVs占致病性CNVs的5/15（33.3%），其中有3例片段<5 Mb（60.0%），位于MDs區域的CNVs片段的陽性預測值為5/8（62.5%），52例NIPT檢測提示CNVs樣本的三種檢測方法結果見表3。夫妻雙方備用血驗證結果顯示：致病性CNVs親本來源占4/15，臨床意義不明確CNVs為親本來源占4/7。

2.3 隨訪結果

CMA結果正常、良性的CNVs和臨床意義不明確CNVs孕婦均選擇繼續妊娠，產后隨訪均未發現新生兒表型異常。15例致病性CNVs中有10例選擇引產，5例繼續妊娠。繼續妊娠病例包括2例X染色體異常、1例親本來源CNVs和2例MDs，產后隨訪反饋：2例MDs中1例表型異常，另1例失訪，其余3例暫時表型正常。25例CMA檢測結果提示CNVs病例的隨訪結果見表4。

3 討? 論

NIPT篩查胎兒的CNVs具有良好的臨床應用前景。CNVs發生在染色體上罕見、新生、片段相對大、含有臨床相關基因和已確定的綜合征，稱為致病性CNVs，如果遺傳自健康雙親，或者普遍存在于正常人中未表現出病理學表型的，稱為良性CNVs，其余的稱為臨床意義不明CNVs。致病性CNVs出現在特定染色體上并含有重要基因的區域就可能引起MDs，可導致嚴重智力低下、發育遲緩、生長發育異常等，在胎兒中發生率為1.0%～1.7%[6]。常見的MDs有22q11微缺失綜合征、22q11微重復綜合征、Angelman綜合征、貓叫綜合征等至少67種，發病率在1/4000至1/5000之間。MDs傳統的產前篩查模式為：孕中期B超檢查發現胎兒發育異常或者器官畸形，介入性手術獲得胎兒的組織，基因芯片或新一代測序技術檢測胎兒DNA的CNVs。B超檢測從形態上辨別胎兒發育異常和畸形，不能檢測胎兒器官功能異常和胎兒智力異常，漏診率高。NIPT檢測對象為胎兒的游離DNA，直接判斷游離DNA是否存在CNVs，是否引起MDs，相比B超篩查有明顯優勢。NIPT能從全基因組范圍篩查出致病性CNVs和MDs，本研究發現，28.8%的致病性CNVs檢出率遠高于產前超聲篩查發現胎兒存在多個器官異常時約9.5%的致病性CNVs檢出率[7]。 隨著測序技術的改進以及生物信息分析軟件的完善、更多大樣本研究，NIPT篩查CNVs將更加合理和準確[8]。產前診斷協會（ISPD）2015年聲明中指出NIPT檢測胎兒CNVs可用于臨床意義明確或已知嚴重表型的疾病[9]。本研究52例NIPT陽性樣本中檢測到15例致病性CNVs，有5例可引起MDs，其中3例片段小于5 Mb的占60.0%，陽性預測值為62.5%，高于非MDs區域。因此，NIPT報告審核時，必須注意MDs區域出現的CNVs。NIPT能夠在產前篩查出各種類型的CNVs，包括染色體MDs區域的CNVs。

CNVs驗證應選用CMA作為驗證方法。染色體核型分析方法使用顯微鏡觀察染色體的帶紋變化，一般只能辨別5～10 Mb的染色體結構異常，而染色體核型分析并不適用于驗證CNVs。本研究染色體核型分析CNVs的檢出率僅為32.0%，檢測到的異常片段均大于5 Mb，與以上推斷一致。目前全基因組范圍檢測 CNVs 研究的方法有： CMA、SNP分型芯片技術和新一代測序技術。CMA通過一次雜交可對全基因組范圍內檢測的染色體拷貝數量的變化進行檢查，分辨率在10 kb左右，能夠檢測所有染色體結構失衡，包括非整倍體和所有已知引起智力障礙/多發性先天畸形的復發性染色體失衡。目前一些產前診斷中心已將此方法用于產前診斷CNVs[10]。CMA可用于CNVs的驗證，但必須注意，NIPT檢測結果與CMA并不完全一致。NIPT檢測CNVs是基于測序匹配Reads獲得染色體上不同位置DNA片段的劑量信息。在目前測序深度條件下，測序得到Reads經過了過濾、篩選和換算， NIPT檢測DNA片段的劑量和位置變化并不精確。而CMA檢測卻能夠精確地檢測DNA劑量和位置變化。本研究中NIPT和CMA發現CNVs異常類型（缺失或重復）均一致，但CNVs區域的大小和位置不完全一致。如果NIPT和羊水CMA均提示染色體相近位置出現相同類型的CNVs，說明NIPT提示信號為真信號，均應判斷為真陽性。

CNVs來源驗證及胎兒轉歸隨訪是評價NIPT篩查CNVs臨床效果的重要方法。CNVs的來源是預測胎兒預后的一個重要因素，CMA檢測夫妻備用血可確定CNVs來源。如果CNVs來源于親本，且親本臨床表型正常，則患病風險低，如系新發突變，則應結合文獻報道、涉及基因、片段大小、超聲檢查結果、生育史等綜合判斷。本研究中25例真陽性樣本中共有8例來源于親本，驗證結果可幫助臨床醫生遺傳咨詢和判斷胎兒的預后。15例致病性CNVs中5例繼續妊娠，其中2例為涉及X染色體異常的女胎。由于女性有2條X染色體且存在互補效應，其中1條X染色體異常對胎兒的表型影響較小;1例系母親來源，母親表型正常。3例嬰兒出生后均未出現表型異常。另外2例CNVs會引起MDs，1例產后出現了MDs，另1例失訪。

NIPT檢測CNVs存在假陽性病例現象。NIPT檢測時，由于孕婦外周血的胎兒游離DNA含量僅占血漿總游離DNA的19%左右，并且與母體游離DNA混雜在一起，大量的母體血漿游離DNA背景會給胎兒游離DNA的檢測和分析造成干擾，如果母親染色體異常、DNA拷貝數異常、母血中胎兒DNA含量低以及母親罹患腫瘤等情況，都會引起NIPT假陽性。另外，NIPT檢測胎兒游離DNA來源胎盤滋養層，胎盤與胎兒雖然由同一個合子發育和分化形成，但如果在孕期出現限制性胎盤嵌合、雙胎一胎凋亡等情況可導致胎兒和胎盤DNA不一致，也會引起NIPT假陽性[11～12]。本研究發現NIPT用于篩查CNVs的陽性預測值為48.1%（25/52），假陽性率為51.9%（27/52），與盧建等人報道的NIPT篩查T18和T13的假陽性率達51.1%和51.9%相近[13]。這說明NIPT用于篩查CNVs具有與T18和T13篩查相似的臨床價值， NIPT可用于產前篩查CNVs，但必須通過介入性產前診斷確診。另外，本研究無法收集到計算真陰性和假陰性所需的同期NIPT檢測其他孕婦的篩查結果、產前診斷結果和隨訪數據，無法計算陰性預測值、敏感度、特異性和約登指數等篩檢指標。因此，本研究對NIPT篩查CNVs的效果評價不夠全面，仍有待進一步研究。

綜上所述，NIPT用于篩查CNVs具有較高陽性預測值，能夠檢測出各種類型的CNVs，特別是染色體MDs區域的CNVs，具有良好的臨床應用前景。同時，該技術仍存在一定的假陽性，應進一步結合其他產前診斷方法做出準確診斷。

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（收稿日期：2020-01-12 修回日期：2020-03-24）

（編輯：梁明佩）