易錯PCR 技術提高源于Sulfolobus acidocaldarius 麥芽寡糖基海藻糖合成酶活性

姚鍇琳， 宿玲恰， 吳 敬*

（1. 食品科學與技術國家重點實驗室， 江南大學, 江蘇 無錫214122；2. 江南大學 生物工程學院， 江蘇 無錫214122；3. 江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室， 江蘇 無錫214122；4. 江南大學 教育部食品安全國際合作聯合實驗室，江蘇 無錫214122）

麥芽寡糖基海藻糖合成酶（MTSase，EC 5.4.99.15） 作用麥芽寡糖還原性末端的α-1,4 糖苷鍵使其變為α,α-1,1 糖苷鍵， 生成麥芽寡糖基海藻糖。 麥 芽 寡 糖 基 海 藻 糖 水 解 酶（MTHase，EC 3.2.1.141） 能水解麥芽寡糖基海藻糖中麥芽寡糖與海藻糖相連的α,α-1,1 糖苷鍵，生成海藻糖[1]和減少2 個葡萄糖基的麥芽寡糖， 是淀粉為底物制備海藻糖的關鍵酶。 目前，已經從多種微生物中克隆表達出海藻糖合成酶系[2]，包括中低溫酶系和高溫酶系，如節桿菌屬（Arthrobacter）[3]、根瘤菌屬（Rhizobium）[4]、嗜熱硫礦硫化葉菌 （Sulfolobus solfataricusMT4）[5]、嗜酸熱硫化葉菌 （Sulfolobus acidocaldariusATCC 33909）[6-7]等。 海藻糖高溫酶系通常具有較高的海藻糖轉化率，并且具有良好的熱穩定性，能在較高溫度下轉化淀粉生成海藻糖， 不容易在生產過程中污染雜菌。 但是，高溫酶系相對于中低溫酶系，具有蛋白表達量低的缺點。 因此，提高高溫酶系的蛋白表達量，為工業化生成海藻糖[8-9]奠定基礎顯得愈發重要。

近年來, 非理性設計已經成了酶分子改造的重要手段之一，這主要是由于現階段人們尚未完全掌握對酶的空間構象預測、結構分析等技術。 因此, 通過非理性設計特別是易錯PCR 技術[10-11]結合高通量篩選技術進行酶特性改造的策略依然是人們關注的焦點。源于Sulfolohus acidocaldariusATCC 33909的MTSase 具有良好的熱穩定性、耐酸的特點，但是表達量低成為該酶無法實現工業化生成的制約因素[12]。而目前，國內外尚未有通過非理性設計對高溫來源的Sulfolohus acidocaldariusATCC 33909 的MTSase 進行分子改造的研究報道。本研究中擬通過易錯PCR 技術結合高通量篩選技術對MTSase 進行定向進化，以期獲得酶活提高的突變體酶，為其工業化應用奠定基礎。

1材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒 菌株E. coliJM 109 和E. coliBL21 （DE3）： 為作者所在實驗室前期保藏； 質粒pBackzero：購自大連寶生物公司；質粒pET-24（+）和來源Sulfolobus acidocaldariusATCC 33909 的麥芽寡糖基海藻糖合成酶基因treY：為作者所在實驗室前期保藏。

1.1.2 培養基 LB 液體培養基[13]，LB 固體培養基，SOB 培養基[12]，TB 培養基。

1.1.3 酶和試劑 限制性內切酶（NdeI、HindIII）、T4 DNA 連 接 酶、DNA 聚 合 酶Primer STAR HS、rTaq DNA 聚合酶、DL 5000 和DL 10000 DNA Marker 等：購自大連寶生物公司；細菌蛋白抽提試劑盒：購自康為世紀公司；質粒小量提取試劑盒、膠回收試劑盒：購自天根生化科技有限公司；蛋白凝膠電泳試劑盒、蛋白質Marker 標準品： 購自碧云天生物科技有限公司；麥芽六糖、麥芽糊精（DE 值9～13）：購自Sigma 公司；其他常規試劑：購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 MTSase 基因的易錯PCR 以實驗室早期保藏的源于Sulfolobus acidocaldariusATCC 33909 的麥芽寡糖基海藻糖合成酶基因treY作為易錯PCR的模板，并設計引物YC-PCR-F: 5’-TTTAACATAT GATTAGCGCGACCTATCG -3’, YC -PCR -R:5’ -TTTAAAAGCTTACATACGCACCAGGATAC-3’。PCR體 系（50 μL）：ddH2O（27.0 μL），Mg2+（25 mmol/L，10.0 μL），Mn2+（10 mmol/L，2.0 μL），10×rTaq buffer（5 μL），質粒DNA 模板（0.5 μL），引物YC-PCR-F(10 μmol/L，0.5 μL)，引物YC-PCR-R（10 μmol/L，0.5 μL），dNTP Mix （2.5 mM，4 μL），rTaq DNA 聚合酶（5 U/μL，0.5 μL）。PCR 過程：94 ℃預變性4 min，98 ℃變性10 s，55 ℃退火5 s，72 ℃延伸2 min 20 s，31 個循環，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保溫。

1.2.2 突變文庫的構建 將PCR 所得的基因片段用1 g/dL 的瓊脂糖凝膠電泳分離，使用膠回收試劑盒回收。將回收后的基因片段與克隆載體pBackzero相連接，轉化E. coliJM109 感受態細胞，涂布于LB固體培養基（含100 μg/mL Amp），37 ℃培養8 h，用無菌水將固體平板上的所有陽性克隆洗脫，轉至LB液體培養基（含100 μg/mL Amp），37 ℃培養4 h，用質粒抽提試劑盒提取混合質粒，用限制性內切酶NdeI和HindIII 進行雙酶切， 與表達載體pET-24a 相連接。 將連接產物轉化至E. coliBL21（DE3）感受態細胞， 涂 布 于LB 固 體 培 養 基 （ 含100 μg/mL kanamycin），37 ℃過夜培養，挑取陽性克隆，構建突變文庫。

1.2.3 突變文庫的篩選 采用前期研究所得篩選方法： 以200 μL 0.2 g/dL 的麥芽糊精溶液作為底物，于60 ℃水浴鍋中預熱10 min，加入50 μL 稀釋后的粗酶液，精確反應10 min，加入DNS 試劑終止反應。 于沸水中煮沸7 min，冷卻，加入去離子水稀釋，混勻，取200 μL 于酶標板中，在540 nm 處檢測吸光值。 根據吸光值的大小，篩選出酶活提高的突變體酶。 將酶活提高的突變體送至無錫天霖生物科技公司進行基因測序。

1.2.4 MTSase 的表達及純化 將能夠表達野生型MTSase 和突變型酶的E. coli BL21 （DE3） 接種于10 mL LB 液體培養基 （含100 μg/mL kanamycin），37 ℃過夜培養，按體積分數5%的接種量轉接至TB培養基（含100 μg/mL kanamycin），25 ℃，培養24 h。取一定體積的發酵液，12000 r/min、 離心5 min、棄上清液，用pH 8.0 的緩沖液重懸浮，后用超聲破壁儀破壁，離心后收集上清液，即為發酵粗酶液。

將發酵粗酶液經過75 ℃熱處理1 h，50 g/dL 硫酸銨沉淀，透析，經過陰離子交換柱MonoQ 進行蛋白質純化[12]。蛋白質含量測定采用考馬斯亮藍法。純化后的MTSase 及其突變體用于酶學性質及動力學參數的測定。

1.2.5 MTSase 的酶活測定

1）用20 mmol/L pH 6.0 的檸檬酸緩沖液，將麥芽六糖配成1 g/dL 的溶液， 取190 μL 的麥芽六糖溶液置于60 ℃水浴鍋中預熱， 加入10 μL 稀釋后的酶液， 精確反應10 min， 加入200 μL 1 mol/L NaOH 溶液終止反應，取200 μL 反應液于具塞試管中，加入800 μL 水和1 mL DNS，沸水煮沸7 min，冷卻，加入8 mL 去離子水，混勻。 于540 nm 測定吸光值。MTSase 的酶活定義為：每分鐘消化1 μmol 的麥芽六糖所有酶量[14]。 酶活的計算公式為：

其中△A=A540（空白對照）-A540（樣品）；990.86 為麥芽六糖的相對分子質量；1.0375 為DNS 測定麥芽六糖質量濃度標準曲線的斜率；N 為稀釋倍數。

2）以麥芽糊精作為篩選底物時，MTSase 的酶活定義為：每分鐘相當于轉化1 μmol 葡萄糖變為非還原性糖所需要的酶量。 酶活的計算公式為：

其中△A=A540（空白對照）-A540（樣品）；180 為葡萄糖的相對分子質量；0.2116 為DNS 測定葡萄糖含量標準曲線的斜率；N 為稀釋倍數。

1.2.6 酶學性質探究

1）最適溫度。 用20 mmol/L pH 6.0 的檸檬酸緩沖液，將麥芽六糖配成1 g/dL 的溶液，將190 μL 底物置于45～90 ℃（梯度為5 ℃）水浴鍋中預熱，加入10 μL 稀釋后的酶液， 精確反應10 min， 加入200 μL 1 mol/L NaOH 溶液終止反應，取200 μL 反應液于具塞試管中，加入800 μL 水和1 mLDNS，沸水煮沸7 min，冷卻，加入8 mL 去離子水，混勻。 于540 nm 測定吸光值。 定義最高酶活為100%。

2）溫度穩定性。將酶液用pH 6.0 的緩沖液稀釋后，置于70 ℃中保溫，定期取樣，按照方法1.2.5 所述的方法測定殘余酶活，設定0 h 酶活為100%。

3）最適pH。 用20 mmol/L pH 4.0～8.0（梯度為0.5）的緩沖液溶解底物，配成1 g/dL 的麥芽六糖溶液，將190 μL 底物置于60 ℃水浴鍋中預熱， 加入10 μL 稀釋后的酶液，精確反應10 min，加入200 μL 1 mol/L NaOH 溶液終止反應， 取200 μL 反應液于具塞試管中，加入800 μL 水和1 mLDNS，沸水煮沸7 min，冷卻，加入8 mL 去離子水，混勻。 于540 nm測定吸光值。 定義最高酶活為100%

4）pH 穩定性。 將酶分別置于20 mmol/L pH 4.0～10.5（梯度為0.5）的緩沖液中，于4 ℃靜置24 h，按照1.2.5 的方法測定酶活，定義0 h 酶活為100%。

5）Km值的測定。 用20 mmol/L pH 6.0 緩沖液溶解底物， 配成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5 g/dL的麥芽六糖， 將190 μL 底物置于60 ℃水浴鍋中預熱， 加入10 μL 稀釋后的酶液，精確反應10 min， 加入200 μL 1 mol/L NaOH 溶液終止反應， 取200 μL 反應液于具塞試管中， 加入800 μL 水和1 mL DNS，沸水煮沸7 min，冷卻，加入8 mL 去離子水，混勻。 于540 nm 測定吸光值。 使用GraphPad Prism 5 軟件進行擬合分析， 計算得出Km值。

1.2.7 MTSase 的結構預測及突變位點分析 野生型的MTSase 的蛋白質結構通過數據庫protein data bank 中獲得（PDB ID 1IV8），突變體的結構則是通過SWISS-MODEL 進行同源建模獲得的， 應用Pymol 進行酶分子擬合。

2結果與分析

2.1 易錯PCR 條件的探究

在易錯PCR 過程中， 需要加入Mg2+和Mn2+，Mg2+能與核酸骨架相互作用，起到穩定作用。 同時，Mg2+還能影響到DNA 聚合酶的活性。 Mg2+濃度過低，會降低PCR 的擴增效率，甚至導致擴增失敗。但是，Mg2+濃度過高，則會產生非特異性擴增。 Mn2+能降低DNA 聚合酶對模板的特異性， 增加PCR 過程中堿基互補的出錯率。 因此，在易錯PCR 過程中需要調整2 種離子的濃度，以期獲得不同突變頻率的突變文庫。 本研究中，以常規PCR 中5 mmol/L Mg2+濃度作為初始濃度， 通過調整體系中Mn2+的濃度，來探索易錯PCR 條件。 PCR 結果如圖1 所示。

圖1 不同Mn2+濃度下的PCRFig. 1 Error-pone PCR with different Mn2+ion concentrations

從圖1 中可知，Mg2+濃度為5 mmol/L 時， 結合不同濃度的Mn2+濃度， 均能使得目的基因有效擴增。 因此，Mg2+濃度選擇為5 mmol/L。 在選定的Mg2+條件下，不同濃度的Mn2+濃度均能使得目的有效擴增，但是，考慮到Mn2+濃度過高會產生較高的出錯率，使得后續表達的MTSase 失活；而Mn2+濃度過低會則出錯率太低，甚至不發突變。 較為合適的出錯率為MTSase 氨基酸序列中有2～5 個氨基酸突變。通過對不同濃度Mn2+PCR 產物測序，根據測序結果和2～5 個氨基酸突變為宜的突變原則，選擇了Mn2+濃度0.4 mmol/L。

2.2 突變文庫的構建及篩選

經過初步的易錯PCR 條件探究后， 在確定的PCR 條件下擴增MTSase 的基因treY，經PCR 產物純化后，連接到克隆載體pBackzero 上，轉化E. coli JM 109 感受態細胞，涂布平板，將平板上所有菌落用無菌水洗脫至LB 液體培養基，過夜培養后，提取混合質粒pBackzero-treY， 將混合質粒pBackzerotreY 和表達載體pET-24a 分別經NdeI 和HindIII雙酶切后，16 ℃過夜連接， 轉入E. coli BL21（DE3）感受態細胞中。 本研究突變獲得到轉化子約5000株，所有轉化子構成突變文庫。

2.2.1 初篩 由于麥芽六糖價格昂貴，不適合用作篩選的底物。 因此，以價格低廉的麥芽糊精作為篩選的底物。 對構建好的突變文庫，采用前期設計的篩選方法，進行初篩：將突變體與底物反應后的反應液同DNS 試劑進行顯色反應， 置于酶標板中于540 nm 處測定吸光值，計算酶活。 初步篩選出酶活有較大幅度提高的突變株，（圖中所示數值是以麥芽糊精為底物所計算的酶活（U/mL），紅色框表示酶活有較大幅度提高的突變體， 黑色表示野生型MTSase，橙色框表示空白對照，即用緩沖液替代酶液）。 初篩結果見圖2 所示。

圖2 深孔板初篩結果Fig.2 Screening result of MTSase in the 96-well plate

2.2.2 復篩 將初篩獲得的陽性轉化子，5%接種體積分數接種于TB 液體培養基 （含100 μg/mL kanamycin），于25 ℃培養24 h，取一定發酵液，離心棄上清液，用pH 8.0 的緩沖液重新懸浮后，用超聲破碎菌體，離心收集上清液，以麥芽六糖作為底物，測定酶活。 對突變文庫篩選后，獲得酶活提高較為顯著的突變體D-6，其粗酶液酶活為41.2 U/mL，而野生型MTSase 酶活為26.65 U/mL。 突變體粗酶液酶活為野生型的1.54 倍。

2.3 突變體的基因測序

對酶活提高的突變體D-6 進行測序，發現D-6的基因在1295 和1757 位點發生突變， 其氨基酸序列均產生突變。 其序列分析結果如表1。

2.4 MTSase 及其突變體的分離純化

離心收集發酵液中的菌體，使用高壓勻漿機進行細胞破碎，8000 r/min，離心15 min，收集上清液，經過75 ℃熱處理1 h，50 g/dL 的硫酸銨沉淀，透析，MonoQ 陰離子交換層析柱這3 步純化后，獲得電泳純的野生型MTSase 和突變體D-6， 其SDS-PAGE分析結果如圖3 所示。 對純化后的野生型MTSase和突變體D-6 進行比活力測定， 分別為75.1 U/mg 和92.2 U/mg， 突變體酶的比活力為野生型MTSase 的1.22 倍。 同時，經計算可知突變體D-6 的粗酶液目的蛋白可溶性表達量為0.447 mg/mL， 而野生型MTSase 為0.356 mg/mL，表明突變體D-6 可溶性蛋白表達量提高。

表1 突變體測序結果Table 1 Sequencing results of the mutant

圖3 純化后的野生型MTSase 和突變體酶D-6 的SDSPAGE 分析Fig. 3 SDS-PAGE of purified WT-MTSase and mutant MTSase D-6

2.5 MTSase 及突變體的酶學性質分析

2.5.1 最適溫度及溫度穩定性分析 酶催化過程中，酶活力與溫度密切相關。 當溫度低于最適溫度時，隨著溫度升高，酶促反應速率加快；當溫度高于最適溫度時，隨著溫度升高，酶促反應速率反而呈現下降趨勢。 因此，需要探究突變體酶D-6 同野生型MTSase 在最適溫度和溫度穩定性上的差異。 突變體酶D-6 和野生型MTSase 的最適反應溫度和溫度穩定性結果如圖4 和圖5 所示。

從圖4 可知， 野生型MTSase 的最適反應溫度為70 ℃，而突變體酶D-6 的最適反應溫度為60 ℃，較野生型MTSase 的最適溫度略有下降。 從圖5 可知，70 ℃下保溫，D-6 的半衰期為5 d， 在相同條件下，而野生型MTSase 的相對酶活在5 d 時能保持在75.2%以上， 突變體酶D-6 的溫度穩定性同野生型MTSasse 相比略有下降。 根據吳世雄等人報道[12]，雙酶法制備海藻糖最適反應溫度為60 ℃， 反應時間48 h，便能達到最大產率。 考慮到D-6 的熱穩定性有所下降， 同時考察了突變體D-6 和野生型MTSase 在60 ℃保溫48 h 后的殘余酶活。結果如圖6所示，保溫48 h 后，突變體D-6 的殘余酶活仍保持在80%以上。 因此即便溫度穩定性略有下降，也不會影響該突變體應用于海藻糖的制備。

圖4 野生型MTSase 和突變體酶D-6 的最適溫度Fig. 4 Optimum temperature of WT-MTSase and D-6

圖5 野生型MTSase 和突變體酶D-6 的70 ℃溫度穩定性Fig.5 Thermal stability of WT-MTSase and D-6 at 70 ℃

圖6 野生型MTSase 和突變體酶D-660 ℃溫度穩定性Fig.6 Thermal stability of WT-MTSase and D-6 at 60 ℃

2.5.2 最適pH 及pH 穩定性分析 酶催化過程中，pH 即可以影響酶同底物的親和力， 也能影響酶的穩定性。 因此，本研究需要探究突變體酶D-6 同野生型MTSase 在最適pH 和pH 穩定性上的差異。 在其他條件不變的情況下， 用方法1.2.6 測定突變體酶D-6 和野生型MTSase 的酶活。 結果如圖7 和圖8 所示。 突變體酶D-6 和野生型MTSase 的最適pH均為6.0。 野生型MTSase 在pH 4.0～10.5 相對酶活維持在89%以上， 而突變體酶D-6 在同等情況下，相對酶活維持在91.7%以上。 當大于pH 7.0 時，突變體酶D-6 的pH 穩定性優于野生型MTSase。

2.5.3 酶促反應動力學分析 用純化后的野生型MTSase 和突變體酶D-6，以不同濃度的麥芽六糖作為底物測定其動力學參數Km。 其結果用GraphPad Prism 5 軟件進行計算， 野生型MTSase 的Km值為（4.74±0.33）mmol/L，突變體酶D-6 的Km值為（2.77±0.22） mmol/L，表明突變體酶對底物的親和性提高。

圖7 野生型MTSase 和突變體酶D-6 的最適pHFig. 7 Optimum pH of WT-MTSase and D-6

圖8 野生型MTSase 和突變體酶D-6 的pH 穩定性Fig. 8 Effect of pH on the stability of WT-MTSase and D-6

2.6 突變位點分析

在protein data bank 數據庫中獲取野生型MTSase 的蛋白質三維結構（PDB ID：1IV8）。 通過氨基酸序列比對， 突變體同野生型MTSase 的同源性為99%。 因此，突變體酶D-6 的蛋白質三維結構以野生型MTSase 蛋白質結構作為同源模板， 應用SWISS-MODEL 進行同源建模。

圖9 MTSase 的活性中心與底物對接Fig. 9 Docking of the active center of MTSase with the substrate

G432 位點位于MTSase 的表面親水區域，當G432 變成D432 后，側鏈結構變大，親水性變強，使得酶分子之間的疏水相互作用變弱， 不容易聚集，這可能在一定程度上減少包涵體的形成， 提高MTSase 的可溶性表達量。

突變位點G586D 位于Aβ8 與AEα14 的loop環上[15]，與氨基酸D596 和R600 位于同一loop 環上，而根據Wen-Chi Tseng 等[16]報道，D596 和R600 能與-2 及-3 位點的葡萄糖殘基結合， 當G586 變成D586，loop 環的剛性變強[17]，從而使得D596 和R600與底物結合更加穩定。 推測是由于這個原因使得酶與底物的親和性提高。

3結 語

高溫酶系的MTSase 的酶活普遍偏低， 如源于Sulfolobus solfataricusATCC 35092[18]MTSase 在E.coliBL21 （DE3） 表 達 的 酶 活 僅 有0.222 U/mL，而Sulfolobus acidocaldariusATCC 33909 的MTSase 在E. coliBL21（DE3）、Brevibacillus brevis、B. subtilis表達的酶活分別為26.65、16.3、17.5 U/mL[12]。 本研究對源于Sulfolobus acidocaldariusATCC 33909 的MTSase進行定向進化，結合高通量篩選技術，獲得了一株酶活提高的突變體酶D-6， 其酶活為41.2 U/mL。測定了突變體酶D-6 的酶學性質，突變體酶D-6在60 ℃保溫48 h 后， 殘余酶活仍保持在80%以上。 因此，雖然突變體酶溫度穩定性較野生型略有下降，但是不影響其應用。 此外，希望以突變體酶D-6 最為出發菌，繼續進行高通篩選，以期獲得酶活提高更加顯著的突變體，為工業化生產奠定基礎。