定點突變提高過氧化氫酶熱穩定性和催化效率

MUGISHA Samson， 楊套偉， 徐美娟， 張 顯， ULIHO Alphonse，錢海峰， 王 立， 饒志明*

（1. 江南大學 生物工程學院， 江蘇 無錫214122；2. 江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室， 江蘇 無錫214122；3. 江南大學 食品學院，江蘇 無錫214122）

過氧化氫酶（過氧化氫氧化還原酶，EC1.11.1.6）廣泛存在于好氧生物中，在動植物、細菌、真菌、古生菌中。它通過歧化作用直接分解由活性氧ROS 產生的過氧化氫形成水和氧氣。其中，ROS 是由細胞正常生長過程中線粒體電子傳遞所形成的。 然而，過多的ROS 和自由基會導致細胞氧化性損傷甚至死亡[1-3]。因此，在氧化還原不平衡時，過氧化氫酶通過催化過氧化氫分解起到了解毒作用[4]。 此外，過氧化氫酶廣泛應用于食品加工、紡織和臨床檢測中[5-7]。

根據其功能特點， 過氧化氫酶被分為3 類: 含血紅素過氧化氫酶、 過氧化氫-過氧化物雙功能酶以及含錳離子的過氧化氫酶[8-9]。 其中單功能的過氧化氫酶由于其商業價值而受到更多的關注。 目前，許多研究者致力于篩選不同微生物來源的過氧化氫酶，并進行同源或異源表達，以適用于不同的用途[10-13]。蛋白質工程策略已被廣泛應用于提高靶蛋白的性能，其中基于結構模擬和計算等理性設計的定點突變來改造蛋白的方法已被廣泛使用[14-18]。 研究報道了不同種類的酶通過定點突變成功的提高了其催化能力及熱穩定性[18-19]，但是對過氧化氫酶進行熱穩定性改造的報道卻較少[20-21]。

短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）由于具有多種抗氧化酶，從而比其他微生物具有更好的抗氧化能力[22-23]。本研究中, 選擇B. pumilusML413 來源的過氧化氫酶作為研究對象。 另外，菌株枯草芽孢桿菌168 由于具有良好的分泌表達能力而被廣泛作為工業表達宿主[24-25]，同時也被用來作為過氧化氫酶的異源表達的宿主菌。 本研究采用枯草芽孢桿菌168作為過氧化氫酶表達宿主菌， 利用 PoPMuSiC algorithm 軟件計算并預測了B. pumilusML413 血紅素過氧化氫酶(KatX2)的活性中心潛在突變位點的折疊自由能，對該位點附近的氨基酸進行一系列定點突變來提高該區域的疏水性，從而提高過氧化氫酶的熱穩定性。

1材料與方法

1.1 菌株，質粒和材料

B. pumilusML413 為本研究室保藏。E. coliJM109 和B. subtilis168 分別作為克隆和表達菌株。質粒pMA5 和pMD18-T 分別作為表達和克隆載體。 PrimeSTARe 擴增酶、ExTaq DNA 擴增酶、T4 DNA 連接酶、限制性內切酶BamHI 和MluI，購自寶生物（大連）有限公司；DNA 提取試劑盒、質粒提取試劑盒、DNA 回收試劑盒，購自生工生物工程（上海）有限公司；HisTrapTMHP 純化柱，購自美國通用醫療集團；其他試劑均為商業化商品。

1.2 定點突變及重組菌株的構建

以B. pumilusML 413 的DNA 為模板， 用引物KatX2 F 和KatX2 R（表1）進行PCR 擴增得到過氧化氫酶基因。 擴增產物經純化后與克隆載體pMD18-T 連接獲得重組質粒pMD18T-KatX2.用BamHI 和MluI 對pMD18T-KatX2 和pMA5 分別進行雙酶切， 純化后， 將得到的KatX2 和線性化的pMA5 進行連接獲得重組質粒pMA5-KatX2, 隨后將該重組質粒利用Spizizen 描述的方法轉化到枯草芽孢桿菌168 中[26]。 以重組質粒pMA5-KatX2 為模板，用表1 所示的引物進行重疊延生PCR 的方法進行定點突變[27]。 含突變基因的質粒轉入到大腸桿菌JM109 中并驗證，并送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，測序正確的重組質粒轉入到枯草芽孢桿菌168 中進行表達， 以菌株B.subtilis168/pMA5-KatX2 作為對照。

表1 引物序列表Table 1 Nucleotide sequences of primers

1.3 培養條件

挑取單菌落于10 mL 含50 mg/L 卡那霉素的LB 培養基，37 ℃，180 r/min 過夜培養后， 以10%的接種體積分數接種于含50 mg/L 卡那霉素的發酵培養基(甘油47 g/L, NH4Cl 1.5 g/L, 玉米漿15 g/L，K2HPO42.7 g/L，KH2PO42.1 g/L，MgSO4·7H201.9 g/L，NaCl 5 g/L， 酵母粉35 g/L，FeSO4·7H2O 0.0025 g/L，pH 7.0)中培養54 h。 在4 ℃下，10000 g 離心20 min，離心后收集上清液，并用0.22 mm 濾膜過濾后備用。

1.4 過氧化氫酶的純化

為防止酶的降解，純化在4 ℃條件下進行。 首先，用終體積分數為60%的乙醇沉淀發酵液中的蛋白質，10000 g 離心30 min 收集蛋白質沉淀。接著，用磷酸鉀緩沖液（20 mmol/L，pH 7.0）懸浮，并用該緩沖液透析12 h 以除去多余離子。最后，將收集的樣品用Ni2+親和色譜層析的方法，利用AKTA 蛋白純化儀（GE Healthcare，USA）進行純化，流速0.5 mL/min，用binding buffer（0.02 mol/L Tris-HCl buffer, 0.5 mol/L NaCl, pH 7.4）將粗酶液吸附至1mL HisTrapTMHP 純化柱上，并用0～0.5 mol/L 的咪唑梯度洗脫得到過氧化氫酶純酶。 用Bradford 法測定蛋白質濃度[28]. 用SDS-PAGE 對蛋白質的表達及純化情況進行分析。

1.5 酶活測定

過氧化氫酶的酶活測定在37 ℃下進行。 將100 μL 的酶溶液加入到3 mL 反應液（50 mmol/L 磷酸鉀緩沖液（pH 7.0），10 mmol/L H2O2）中，在240 nm測定60 s 內吸光度的變化[29]。 酶活單位：在37 ℃下降解1 μmol 過氧化氫所需的酶量定義為1 個酶活單位。

1.6 過氧化氫酶酶學特性分析

1.6.1 過氧化氫酶動力學參數 用pH 7.0、50 mmol/L PBS 緩沖液配置10～90 mmol/L 的過氧化氫底物溶液在37 ℃條件下測定酶活。 利用Lineweaver-Burk雙倒數法作圖計算得到動力學參數Km，Vmax及Kcat值。

1.6.2 pH 及溫度對酶的影響 在37 ℃下， 采用不同pH 的緩沖液中測定酶的最適pH。 最適pH 測定所用的緩沖液如下： 檸檬酸鈉緩沖液 （50 mmol/L,pH 4～6）, PBS 緩沖液（50 mmol/L，pH 6～8）, Tris-HCl緩沖液（50 mmol/L，pH 8～10） 和 甘氨酸-NaOH 緩沖液（50 mmol/L，pH 10～13）. 在4 ℃下，將酶浸入不同pH 的緩沖液中靜置24 h 后測定剩余酶活，得出該酶的pH 穩定性曲線。 在最適pH 條件下，在10～60 ℃之間測定最適反應溫度。 將在不同溫度下置于不同時間, 冰上放置15 min 后測定剩余酶活，得出該酶的熱穩定性曲線。

1.6.3 金屬離子的影響 將酶分別加入含有1 mmol/L不同的金屬離子（Ni2+、Mn2+、Zn2+, Mg2+、Cu2+、K+、Fe2+和Co2+） 的磷酸緩沖液（50 mmol/L, pH 7.0）10 min后測定酶活，以不添加金屬離子的磷酸緩沖液作為對照。

1.7 結構建模

利用SWISS-MODEL protein modeling server（http://swissmodel. expasy.org/）， 以 短 小 芽 孢 桿 菌MTCCB6033 過氧化氫酶(PDB id: 4qol. PubMed id:25663126) 為模板進行同源建模。 利用Discovery Studio Client 2.5 和PyMOL View 軟件來得到突變后的模型結構并分析二級結構的改變。 用PoPMuSiC-2.1 algorithm 工具來找尋可能提高熱穩定性的突變位點，并計算其吉布斯自由能[30]。

2結果與討論

2.1 突變位點的選擇

在本實驗中， 以短小芽孢桿菌MTCCB6033 過氧化氫酶蛋白質(PDB id:4qol.PubMed id:25663126)結構為模板， 構建了野生型和突變株的3D 結構。Swiss model 選擇的模板與同源建模得到的結構有99.39% 的相似性。

KatX2 由4 個相同的亞基組成， 每個亞基有3個對催化起關鍵作用的氨基酸殘基（His57、位于血紅素腔的Asn130 以及在保守區域的Asn130）[31]。利用PoPMuSiC-2.1 algorithm 工具預測了各個殘基突變后自由能的改變，根據預測的結果，我們選擇了其中自由能最低的3 個突變株（K117V、K117I 和K117M 的折疊自由能分別為-2.23, -2.58 kcal/mol和-1.84 kcal/mol）進行突變。同時考慮到位于活性中心附近α-螺旋的氨基酸殘基對酶的熱溫度性起到關鍵作用，并且苯丙氨酸對蛋白的穩定性有關鍵作用[32]，因此我們將M177 突變成苯丙氨酸。 構建4 個過氧化氫酶突變體，并在枯草芽孢桿菌168 中進行表達。

2.2 過氧化氫酶的過表達和純化

通過SDS-PAGE 分析表明，B. subtilis 168/pMA5-KatX2 以及分別含有KatX2 突變體K117V、K117I、 K117M 和M177P 的重組菌均構建成功。 純化后，SDS-PAGE 分析表明純化效果較好無雜質蛋白條帶，氧化氫酶相對分子質量大小為5.8×104（圖1）。 野生酶和突變株K117V、K117I、K117M、M177P的比酶活分別為27559、36297、33582、29896 U/mg和31024 U/mg。

表2 突變前后酶反應動力學參數Table 2 Kinetic parameters of the purified wild-type catalase (KatX2) and its mutants

圖1 野生型過氧化氫酶KatX2 及其突變株K117V、K117I、K117M 和M177P 純化后的SDS-PAGE 分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of the purified wild-type KatX2 and its mutants K117V，K117I，K117M and M177P

2.3 過氧化氫酶突變體酶學特性分析

過氧化氫酶突變前后的酶學特性如表2 所示。將K117 分別突變為疏水性的殘基（Val、Ile 和Met）比酶活分別提高了31.7%、21.8%和8.48%，60 ℃的半衰期分別提高了38、23 min 和9 min。 K117V 和K117I 的kcat分別為319427 s-1和317185 s-1，比野生型展現出更高的催化效率。 根據結構分析可知，117 位的賴氨酸突變為疏水的纈氨酸后，會與92 位的苯丙氨酸形成2 個氫鍵的連接，并且與疏水性的93 位纈氨酸和119 位酪氨酸共同形成一個疏水性的孔道（圖2（b））。 疏水性的孔道與位于血紅素附近主孔道的催化殘基Asp110 和Asn130 相連接。之前的研究報道表明，活性位點附近的疏水性對酶的穩定起關鍵作用[33]，疏水區域由于能增強穩定性，這可能是因為它增強了α-螺旋和β-折疊結構域之間的聯系，而這一點與作為底物結合位點的配體有關[31]。 因此117 位親水性的賴氨酸突變為疏水性的纈氨酸并在活性中心形成疏水區域是提高酶熱穩定性的原因。 將Lys117 突變為其他疏水氨基酸（異亮氨酸和蛋氨酸） 加強了與周圍Phe114、Ala115、Val116、Phe118 和Tyr119 的相互作用，使疏水區域更加穩定， 從而提高了酶的催化效率和熱穩定性。另外，將Met177 突變成脯氨酸，脯氨酸起著維持蛋白質形狀和折疊的重要作用，從而提高蛋白質構象穩定性和催化效率[32]. 如圖2（c）和2（d）所示,Met177和突變株P177M 通過同樣的氫鍵與Trp180、Leu181 和Ser174 形成極性連接， 但是熱穩定性和催化活性卻有所差異，這可能是由于脯氨酸殘基能提高構象的穩定性所導致的。

2.4 溫度、pH 和金屬離子對突變體的影響

突變后，最適催化溫度未發生改變，均為40 ℃（表3），這與B.pumilusB4W 來源的過氧化氫酶相同[22]。 該結果與此前報道的常溫微生物來源的過氧化氫酶在15～55 ℃相一致[34]。所有的突變株在40 ℃下均保持良好的熱穩定性，在20 ℃下儲藏20 h，酶活能保留90%以上。 在60 ℃，酶活下降速度顯著加快，野生型在60 ℃下的半衰期為220 min（見圖3），突變體K117V 在60 ℃下的半衰期提高了38 min。

圖2 過氧化氫酶及其突變的結構分析Fig.2 Structural model analysis of the wild-type KatX2 and its mutants

表3 突變前后過氧化氫酶酶學特性Table 3 Characterization and thermostability of the wild-type catalase (KatX2) and its mutants

圖360 ℃下野生型過氧化氫酶及其突變株熱穩定性Fig.3 Thermo-stability of the wild-type KatX2 and its mutants at 60°C.

此外， 作者研究了野生型和突變株的pH 穩定性。 結果如圖4 所示，突變前后在pH 7 的條件下均較穩定， 能保留95%的酶活。 突變株K117V 在pH 12 的條件下保留了67%的酶活，展現出比野生型更好的pH 穩定性。其他突變株在pH 4.0～13.0 的條件下，pH 穩定穩定性與野生型相似。 作者同樣研究了金屬離子對突變后酶活的影響。 如圖5 所示，金屬離子對過氧化氫酶突變前后的影響基本一致。 Fe2+和Mg2+對酶活有促進作用。 Co2+對酶活有一定的抑制作用， Cu2+對過氧化氫酶有較強的抑制作用，但與較野生型相比較，Cu2+突變株K117V 抑制性有所降低。

圖4 pH 對過氧化氫酶穩定性的影響Fig.4 Effect of pH on enzyme stability of the wild-type KatX2 and its mutants

圖5 金屬離子對過氧化氫酶酶活的影響Fig.5 Effect of metal ions on the activities of wild-type KatX2 and its mutants

3結 語

通過對B. pumilusML413 血紅素過氧化氫酶K117 進行定點改造，提高了過氧化氫酶的熱穩定性和催化活力。 突變株K117V 在60 ℃的半衰期提高了38 min, 并且比酶活提高了31.7%， 其他的突變株在熱穩定性和催化能力上也有所提高。 我們從酶分子結構上對造成熱穩定性和酶學特性提高的原因進行了分析，疏水性氨基酸以及脯氨酸的引入是造成該變化的原因。 突變后的過氧化氫酶顯示出更好的適用范圍，具有工業化應用的潛力。