鈣鹽沉淀法從酮酸發酵液中提取α-酮戊二酸

彭小雨， 曾偉主， 周景文， 徐國強*

（1. 江南大學 生物工程學院， 江蘇 無錫 214122；2. 江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室， 江蘇 無錫214122； 3.江南大學 糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫214122）

α-酮戊二酸（α-KG）作為重要的二元羧酸，參與微生物體內的碳氮代謝，并在整個碳氮代謝過程中起著至關重要的作用[1-2]；在食品、制藥、化學以及動物飼料等行業具有廣泛的應用[3-4]。丙酮酸（PA）又稱2-氧代丙酸，是最重要的氧代羧酸之一[5-6]，參與細胞體內的能量代謝，并在其中扮演著極其重要的角色。 目前，化學合成法因生產成本高，環境污染嚴重等缺點逐漸被無污染的生物發酵法所取代。 本實驗室在2010 年篩選出了一株以甘油為碳源并過量積累α-酮戊二酸的菌株（Yarrowia lipolytica WSHZ06），利用此菌株生產α-酮戊二酸，產量高達39.2 g/L，但是丙酮酸的產量卻高達16.8 g/L[7]。 為了能夠減少丙酮酸的積累，同時又能夠過量積累α-酮戊二酸，研究人員采取了代謝改造[8-9]和過程優化[10-11]等策略來達到這一目標，但是丙酮酸積累的問題依然存在。 酮酸聯產為整個實驗提供了一個新的思路。在前期工作中本研究室對于發酵優化聯產酮酸已經達到很好的效果，α-酮戊二酸和丙酮酸的產量分別高達67.4 g/L 和39.1 g/L[12]。

由于α-酮戊二酸和丙酮酸的化學性質和物理性質較為相似，一般常用的分離提取方法無法將兩者進行有效的分離。 Pal 等對于反應萃取法的研究比較多，先后采用了不同的單一萃取劑（磷酸三丁酯[13]，三辛胺[14]，三丁胺[15]）和混合萃取劑（磷酸三丁酯，三辛胺，季胺氯化物）來分離發酵液中的丙酮酸[16]。但是大量的有機溶劑的使用以及復雜的操作程序也限制該方法在工業上的廣泛應用。 在2013 年，占宏德等通過篩選多種不同類型的交換樹脂發現，D301 樹脂為分離α-酮戊二酸的最佳吸附樹脂，并且通過階段洗脫的策略，使α-酮戊二酸的收率達到了93.2%[17]。 李斌水等采用氯化鈣沉淀發酵液中的α-酮戊二酸[18]，但是發酵液中會出現大量游離的Cl-，Cl-對金屬容器腐蝕性較強且成本高，在工業上大規模應用受到制約。 王東陽等采用氫氧化鈣來沉淀發酵液中的α-酮戊二酸[19]，氫氧化鈣和α-酮戊二酸沉淀結合較少，收率較低。而本文中主要對比了3 種不同鈣鹽（CaCl2，CaCO3和Ca（OH）2）對發酵液中酮酸的影響，最后建立一種有效分離發酵液的α-酮戊二酸的鈣鹽沉淀方法。 并對分離提取過程工藝進行了探索，希望能為酮酸的提取和純化提供理論參考。

1材料與方法

1.1 試劑與儀器

丙酮酸和α-酮戊二酸標品，購于上海國藥集團有限公司；濃硫酸、CaCl2、CaCO3和Ca（OH）2等均為國產分析試劑。 酮酸發酵液：由本實驗室發酵所得（菌株：Yarrowia lipolytica WSH-Z06 C3），含有44.68 g/L的α-酮戊二酸和36.93 g/L 的丙酮酸。

恒溫培養箱：上海醫療器械研究所產品；恒溫搖床： 上海精密儀器儀表有限公司產品；15 L 發酵罐：迪必爾生物工程有限公司產品；臺式高速離心機：德國艾本德公司產品；pH 計：瑞士梅特勒-托利多公司產品；Agilent 1260 高效液相色譜儀：美國安捷倫公司產品。

1.2 實驗方法

1.2.1 發酵液的預處理 根據Zhou 的發酵方法[7]，利用解脂亞洛酵母WSH-Z06 C3 發酵生產酮酸，待發酵結束后， 將酮酸發酵液在8000 g 的條件下離心20 min，去除沉淀物，收集上清液。 然后通過納濾膜儀器除去上清液中的大分子物質相對分子質量（＞500），如蛋白質、色素。 備用。

1.2.2 鈣鹽沉淀法分離α-酮戊二酸 配制50 g/L的α-酮戊二酸標準溶液， 取50 mL α-酮戊二酸水溶液，加入等摩爾質量的鈣鹽固體。 待固體完全溶解后，用質量分數為50%的Ca（OH）2緩慢調節pH至3 個梯度：6.0、6.5 和7.0。沸水浴加熱至上清液澄清（15 min），抽濾，量取濾液體積，高相液相色譜法（HPLC）檢測濾液中α-酮戊二酸的含量。

1.2.3 鈣鹽沉淀法分離丙酮酸 配制50 g/L 的丙酮酸標準溶液，取50 mL 丙酮酸水溶液，加入等摩爾質量的鈣鹽固體。 待固體完全溶解后，緩慢加入質量分數為50%的Ca（OH）2使溶液的pH 在6.0～7.0之間。 沸水浴加熱至上清液澄清（15 min），抽濾，量取濾液體積，HPLC 檢測濾液中α-酮戊二酸的含量。

1.2.4 數據計算方法

式中：R1，樣品的最終回收率，%；m1，烘干后的鈣鹽沉淀質量，g；ρ， 初始酮酸質量濃度，g/L；V， 初始體積，mL；P2，樣品的最終純度，%；F標樣，HPLC 檢測標樣峰面積；F試樣，HPLC 檢測試樣峰面積；m標樣，標樣質量，g；m試樣，試樣質量，g。

1.2.5 HPLC 分析 取1 mL 濾液于8000 g 離心5 min， 將上清液稀釋適當的倍數， 然后經0.22 μL水系濾膜過濾后，進行高效液相色譜分析。 色譜分析條件根據參考文獻[7]。

1.2.6 鈣鹽的檢測 取6 管5 mL 發酵液離心，去除上清液。 將離心后的菌體水洗2 次后， 向其中3管中加入2 mL 2 mol/L HCl， 另外3 管中加入等體積的水，充分混勻后，離心取上清液。 HPLC 檢測上清液中α-酮戊二酸的含量。

2結果與討論

2.1 鈣鹽沉淀法分離α-酮戊二酸

2.1.1 不同鈣鹽沉淀對α-酮戊二酸分離的影響分別以CaCl2、CaCO3和Ca（OH）2為沉淀劑，考察了在3 個pH 梯度（6.0、6.5、7.0）下α-酮戊二酸的回收率，結果如表1 所示。 由表1 可知，以CaCl2為沉淀劑時，隨著pH 值的增加，濾液中的α-酮戊二酸呈下降趨勢， 但是α-酮戊二酸的回收率呈上升趨勢。在pH 6.5 時，α-酮戊二酸的收率達到最高，為98.05%。故選用6.5 作為CaCl2沉淀的pH。以CaCO3為沉淀劑時，α-酮戊二酸的收率并不是隨著pH 值的上升而呈上升趨勢。 在pH 6.5 時，α-酮戊二酸的收率達到最高， 為96.84%。 故選用6.5 作為CaCO3沉淀的pH。 以Ca（OH）2為沉淀劑時，Ca（OH）2沉淀時pH 影響不大， 在pH 7.0 時，α-酮戊二酸的收率達到最高，為96.58%。 故選用7.0 作為Ca（OH）2沉淀的pH。

表1 不同鈣鹽的沉淀結果Table 1 Precipitation capacity of different calcium salts

2.1.2 α-酮戊二酸鈣鹽酸化過程參數的確定 量取200 mL 水， 然后加入不同質量的α-酮戊二酸固體，使α-酮戊二酸的濃度分別為50、100、150、200 g/L。表2 所示顯示了不同質量濃度下所對應的α-酮戊二酸的pH。 如表2 可明顯的觀察到，溶液中有機酸的質量濃度和有機酸的pH 呈正相關。 當質量濃度均達到300 g/L 時，此時溶液pH 為0.93，故酸化α-酮戊二酸鈣沉淀過程中可以盡可能提高α-酮戊二酸質量濃度。 但為了完全地置換出α-酮戊二酸，溶液pH 應該調節至低于該質量濃度α-酮戊二酸的實際pH 值。 溶解沉淀物時加入水的體積為酮戊二酸鈣濕重的1～1.5 倍。

表2 不同質量濃度有機酸的pH （25 ℃）Table 2 pH values of different organic acid concentrations（25 ℃）

2.1.3 α-酮戊二酸鈣鹽的純化 前期實驗已經探索了3 種不同的鈣鹽沉淀法對α-酮戊二酸的影響，結果發現CaCl2對α-酮戊二酸沉淀效果最好，收率接近98%。然而向發酵液中加入CaCl2后，發酵液中會出現大量游離的Cl-，Cl-對金屬容器腐蝕性較強且成本高，在工業上大規模應用受到制約。 考慮到CaCO3和Ca（OH）2的沉淀效果相差不大，繼續考察CaCO3和Ca（OH）22 種鈣鹽的純化效果。

在高質量濃度α-酮戊二酸條件下，應用CaCO3和Ca（OH）2都會使溶液呈糊狀，α-酮戊二酸在質量濃度為150 g/L 左右時已十分濃稠，α-酮戊二酸經過CaCO3和Ca（OH）2沉淀和酸化后的得率分別為84.52%和85.19%。 兩者沉淀出的酮戊二酸鈣固體顏色不同，CaCO3沉淀出的固體為白色，Ca（OH）2沉淀出的為淡黃色。 酸化后溶液顏色如圖1 所示，應用Ca（OH）2進行沉淀處理后的α-酮戊二酸溶液顏色深， 應用CaCO3進行沉淀處理后的α-酮戊二酸溶液顏色較淺。 HPLC 檢測結果如圖2 所示，酸化后的溶液，α-酮戊二酸純度分別為：99.18%（CaCO3）和96.78% （Ca（OH）2），結果表明CaCO3是更適合沉淀α-酮戊二酸的鈣鹽。

圖1 標液沉淀后過濾圖Fig. 1 Graph of α-ketoglutaric acid model solution after precipitation

圖2 標液沉淀后過濾液HPLC 檢測Fig. 2 HPLC chromatogram of α-ketoglutaric acid model solution after precipitation

以CaCO3為沉淀劑，按照標液沉淀分離純化的過程來驗證分離發酵液中α-酮戊二酸。結果顯示α-酮戊二酸的收率和純度分別為82.5%和98.89%。 說明鈣鹽沉淀法適用于分離發酵液中的α-酮戊二酸。

2.2 鈣鹽沉淀法分離丙酮酸

分別以CaCl2、CaCO3和Ca（OH）2為沉淀劑，考察了在pH 6.5 丙酮酸的沉淀效果， 結果如圖3 所示。 由圖3 可知，丙酮酸溶液澄清透明，說明鈣鹽沉淀法不適用于丙酮酸的分離提取。

圖3 丙酮酸沉淀結果Fig. 3 Graph of pyruvic acid model solution after precipitation

2.3 鈣鹽沉淀法分離發酵液中酮酸

鈣鹽沉淀法可較好沉淀分離α-酮戊二酸，而無法沉淀丙酮酸，考察該方法是否可用于聯產酮酸的分離。取50 mL 預處理后的發酵液，緩慢加入CaCO3固體，調節pH 至6.5，煮沸20 min，過濾，HPLC 檢測過濾液中有機酸的含量。結果表明α-酮戊二酸的收率為93.42%，但過濾液中丙酮酸相對含量明顯降低，并存在大量的雜質。 如圖4 所示。

由于丙酮酸穩定性差， 沉淀過程中的高溫、偏中性條件可能對丙酮酸有影響，故對這2 個因素進行驗證試驗。

圖4 發酵液沉淀后過濾液HPLC 檢測Fig. 4 HPLC chromatogram of fermentation broth after precipitation

2.4 丙酮酸穩定性分析

2.4.1 溫度的影響 配制50 g/L 的丙酮酸的標準溶液，分別取10 mL 于試管中，加入一定量碳酸鈣，Ca（OH）2調節pH 至6.5，分別置于0、20、30、40、60、80、90 ℃條件下20 min。上清液稀釋50 倍后，HPLC檢測丙酮酸相對含量（峰面積表示）。 結果如圖5 所示。 由圖5 可知，在0～90 ℃之間，隨著溫度的升高，丙酮酸的峰面積有所下降，但是效果不明顯，所以說溫度對丙酮酸的穩定性有較小的影響。

圖5 溫度對丙酮酸的穩定性F ig. 5 Effect of temperature on the stability of pyruvic acid

2.4.2 pH 的影響 配制50 g/L 的丙酮酸標準溶液，分別取10 mL 于試管中，以CaCO3為鈣鹽沉淀劑，配制5 mol/L 的NaOH 調節pH 至6.5。將過濾后的上清液稀釋50 倍，然后用HPLC 檢測溶液中的丙酮酸相對含量（峰面積表示），結果如圖6 所示。 由圖6 可知，向丙酮酸溶液中加入CaCO3對丙酮酸成分的影響較小，但是將pH 調至6.5 時，丙酮酸的峰面積顯著下降，并且周圍雜峰的峰面積開始顯著增加，這說明在pH 6.5 時可能導致丙酮酸發生聚合或者其他反應。當在90 ℃處理20 min 時，丙酮酸的峰面積也下降了，但是沒有pH 對丙酮酸的作用強。

3結 語

圖6 pH 對丙酮酸的影響Fig. 6 Effect of pH on PA

丙酮酸是解脂亞洛酵母生產α-酮戊二酸的主要副產物，發酵過程中若在以Ca（OH）2維持較低的pH 值，發酵過程會積累大量的丙酮酸，而Ca2+有利于丙酮酸的積累；若以NaOH 調節pH，提取過程中酮戊二酸鈣的回收效率低。并且在α-酮戊二酸提取過程中，在偏中性pH 和高溫作用下，α-酮戊二酸的穩定性不受影響，丙酮酸卻容易發生反應生成大量雜質， 且pH 對丙酮酸穩定性的影響大于溫度對它的影響。 因此，當發酵液中含有較高濃度的副產物丙酮酸時，鈣鹽沉淀方法僅能提取純化出α-酮戊二酸，無法同時獲得高濃度的副產物丙酮酸，這將降低α-酮戊二酸的整個工業生產效益。 后期可以通過代謝改造使解脂亞洛酵母發酵高產α-酮戊二酸，而減少丙酮酸的積累， 然后利用鈣鹽沉淀法分離發酵液中的α 酮戊二酸，這樣就能很大程度提高生產效益。