米曲霉形態對L-蘋果酸生產的影響

周 潔， 羅秋玲， 丁 強， 陳修來， 劉立明*

（1. 食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫214122；2. 江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122；3. 江南大學 糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫214122）

L-蘋果酸是一種重要的從可再生能源碳水化合物轉化的化學品， 已被美國能源部列為12 大構架化合物之一。 作為生物體TCA 循環的中間體，L-蘋果酸廣泛應用于食品、煙草、化工和醫藥行業[1]。其具體用途如下：1） 在食品行業：L-蘋果酸可以作為一種酸性和味覺增強劑代替檸檬酸，還可以作為食品保色保鮮劑和食品抗氧化劑等；2） 在煙草行業：蘋果酸衍生物（如酯類）能作為煙草調味劑；3）在化工行業：是良好的絡合劑、酯劑，用于牙膏配方、合成香料配方等，還可以作為除臭劑和工業洗滌劑的成分；4） 在醫藥行業，可作為抗癌藥物前體、血管吻合劑，同時還可以配合各種片劑使其具有水果味，并有助于在體內擴散、吸收。

目前，利用發酵法生產L-蘋果酸時主要使用米曲 霉 （Aspergillus oryzae）、 黃 曲 霉 （Aspergillusflavus）[2-4]。 雖然黃曲霉能高產L-蘋果酸，但其產生的黃曲霉毒素具有強致癌性， 不能作為食品添加劑。 而米曲霉作為食品安全菌株，廣泛用于發酵工業。 米曲霉作為絲狀真菌，在液態深層發酵過程中生長緩慢、機械剪切力耐受性較差，易形成絲狀、團狀和球狀等形態，形態的變化通常會引起發酵液流變性的改變，使其發酵過程變得十分復雜并且難以控制。 絲狀真菌在發酵過程中的形態受多個基因調控，其中包括hypA/podA、swoF和sepA等基因[5]。這些基因編碼的蛋白質控制細胞大小、菌絲極性或細胞間隔膜的間距來改變菌體形態。 菌體形態還受到營養條件（如碳氮源種類及其濃度、金屬離子的添加等）、環境條件（如溫度、pH 值、孢子濃度、攪拌轉速、通氣量、表面活性劑等外源添加物）等因素的影響[6-9]。

曲霉在液體深層發酵過程中，菌體宏觀和微觀形態的變化對代謝產物的合成有重要的影響，不同菌株積累代謝產物最佳形態各不相同。 Aftab Ahamed[10]等人在利用Aspergillus niger生產蛋白酶時發現，當菌體為球狀時蛋白酶產量低于150 U/g，而當菌體為絮狀時蛋白酶產量可超過350 U/g。 而Aspergillus niger生產檸檬酸則以球狀為佳，與菌球相比非菌球生產檸檬酸不僅產量低， 葡萄糖吸收率、氧氣吸收速率和二氧化碳釋放速率都處于低水平[11]。 此外，Aspergillus terreus生產衣康酸和洛伐他汀、Rhizopus oryzae生 產 富 馬 酸、Rhizopus arrhizus生產乳酸等最佳形態都為菌球[12-15]。 作者通過研究營養條件和環境條件對米曲霉菌體形態的影響，確定最佳形態并分析得到菌體形態與L-蘋果酸產量的關系，從而由此調控A. oryzae形態在發酵罐上獲得高產L-蘋果酸。

1材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種A. oryzaeFMME 338 （CCTCC NO：M 2016401） 保藏于中國典型培養物保藏中心。

1.1.2 試劑 L-蘋果酸標準樣品：Sigma 公司產品；葡萄糖：山東西王生化科技有限公司產品；其他化學試劑均為分析純：國藥集團化學試劑有限公司產品。

1.1.3 培養基 斜面培養基 （g/L）： 去皮馬鈴薯200，葡萄糖20，瓊脂15；自然pH。

種子培養基 （g/L）： 葡萄糖60， 胰蛋白胨3，KH2PO40.75，K2HPO4·3H2O 0.98，MgSO4·7H2O 0.1，CaCl20.075，1 mL 微量元素溶液 （NaCl 5, FeSO4·7H2O 5，去離子水1 L）。

發酵培養基 （g/L）： 葡萄糖120，CaCO3（60～100）， 胰蛋白胨6，KH2PO40.2，K2HPO4·3H2O 0.2，MgSO4·7H2O 0.1，CaCl20.075，1 mL 微量元素溶液（同上） 。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養方法 生孢培養： 從-80 ℃的甘油保藏管中取一環孢子懸液接種于斜面培養基，30 ℃恒溫培養箱中培養4～6 d；

種子培養： 將培養的成熟孢子用質量分數0.05%吐溫80 洗下，經玻璃珠打散后過濾制成孢子懸浮液，用血球計數板計數。 將孢子懸浮液轉接至種子培養基中，種子培養基的裝液量為250 mL 的三角瓶中裝入50 mL 培養基， 培養轉速200 r/min，在30 ℃下恒溫搖床培養24 h；

發酵培養（搖瓶）：按體積分數10 %的接種體積分數，將液體種子接種到發酵培養基中，發酵培養基的裝液量為250 mL 三角瓶中裝入50 mL 培養基，轉速200 r/min，30 ℃下恒溫搖床培養6 d；發酵培養（發酵罐）：按體積分數10%接種，將液體種子接種到發酵培養基中，發酵培養基的裝液量為30 L發酵罐裝入16 L 培養基，轉速200～600 r/min，通氣量1～3 vvm，30 ℃下培養6 d。

1.2.2 分析方法 L-蘋果酸和葡萄糖質量濃度測定：用高效液相色譜（HPLC） 分析檢測，色譜柱為AminexHPX-87H Ion （300 mm×250 mm），流動相為5 mmol/L H2SO4，流速為0.6 mL/min；柱溫為35 ℃；波長為215 nm； 進樣量為10 μL；L-蘋果酸質量濃度檢測器為紫外檢測器， 葡萄糖濃度檢測器為示差檢測器；生物量測定：采用干質量法，用2 N 的HCl 除去發酵液中的CaCO3， 將發酵液經濾紙過濾后用蒸餾水洗滌3 遍再抽濾， 置于干燥箱中60 ℃烘干至恒重，用稱重法測定其生物量；菌體形態測定：Canon IXUS115 數碼相機拍攝，菌球直徑使用千分尺測量。

2結果與討論

2.1 氮源對米曲霉菌體形態和產酸的影響

采用單因素實驗在搖瓶中研究有機氮源和無機氮源對A. oryzae 發酵過程中形態和產酸的影響（表1）。結果發現，當以胰蛋白胨和大豆蛋白胨為氮源時，產酸和菌體生長均好于其余氮源。 研究發現，氮源種類對A. oryzae 菌體形態有顯著的影響，除尿素以外，其他所有氮源都能使A. oryzae 在培養基中形成數量、大小都不同的菌球。 氮源對A.oryzae 形態和L-蘋果酸生產的影響如表1 所示。當黃豆粉為氮源時，菌球濃度、菌球直徑、單位體積發酵液菌球總體積（V 值）比胰蛋白胨時分別提高4.90%，4.22%和18.9%；比大豆蛋白胨時分別提高114.0%、28.0%和347.1%。當氮源為黃豆粉和胰蛋白胨時，菌體質量濃度（以干質量計算）在15～16 g/L 左右。 當大豆蛋白胨作為氮源時菌體質量濃度達到最高 （23.7 ± 0.74） g/L。當氮源為胰蛋白胨時，L-蘋果酸產量和得率比大豆蛋白胨時分別提高22.3%和36.6%； 比黃豆粉為氮源時分別提高58.8%和19.1%. 但是，以大豆蛋白胨為氮源時，葡萄糖消耗比胰蛋白胨和黃豆粉時分別高出10.7%和49.2%。 因此，胰蛋白胨是最佳有機氮源。 此外，無機氮源的添加不利于A. oryzae 的生長和L-蘋果酸的積累。 當氮源為尿素時，A. oryzae 在發酵液中以大量菌絲和少量菌球狀呈現（圖1）。 以（NH4）2SO4和NH4Cl 為 氮 源 時， 菌 球 濃 度 分 別 為（110±6） 個/mL 和（86±4）個/mL，菌球直徑分別為（0.625±0.01） mm 和 （0.652 ± 0.01） mm，V 值均不超過15.0 mm3/mL。 以（NH4）2SO4為氮源時，菌體質量濃度比尿素和NH4Cl 時分別提高125.0%和4.85%。 以NH4Cl 為氮源時L-蘋果酸產量比尿素和（NH4）2SO4時分別提高13.8%和5.60%。尿素為氮源時葡萄糖消耗比（NH4）2SO4和NH4Cl 為氮源時分別高出36.7%和27.1%。 然而，當NH4Cl 和（NH4）2SO4為氮源時得率比尿素時均提高47.4%。 所以，NH4Cl為最佳無機氮源。 結果表明，以胰蛋白胨為氮源時，菌球濃度、菌球直徑、V 值、菌體質量濃度、L-蘋果酸產量、葡萄糖消耗和產率比NH4Cl 為氮源時分別提高137.2%、81.7%、1329.0%、158.9%、303.0%、101.5%和100.0%。 表明有機氮源促進菌體生長、L-蘋果酸積累和葡萄糖消耗并提高產率。 因此，胰蛋白胨是最佳氮源。

2.2 CaCO3 質量濃度對米曲霉菌體形態和產酸的影響

表1 氮源對米曲霉形態和L-蘋果酸生產的影響Table 1 Effect of nitrogen source on the morphology of Aspergillus oryzae and the production of L-malate

在培養基中添加CaCO3不僅能控制發酵過程的pH，中和蘋果酸形成鈣鹽沉淀，以固體顆粒存在的CaCO3對菌球形態也有明顯的影響。 研究表明，隨著CaCO3質量濃度從60 g/L 增加到100 g/L，A. oryzae 菌球濃度從208 個/mL 增加到250 個/mL，同時， 菌球直徑從1.173 mm 降低到0.810 mm，V值由（175.4±8.77）mm3/mL 降低到（69.4±1.70） mm3/mL。培養基中CaCO3質量濃度越高，固形物越多，對菌體的磨損程度就越高，菌球直徑逐漸減小。 此外，孢子在萌發過程中包裹一定量的CaCO3更有利于形成菌球。 CaCO3質量濃度對產酸和菌體濃度影響見圖2（a） （b）。 當CaCO3質量濃度為80 g/L 時，菌體濃度比當CaCO3質量濃度為60 g/L 和100 g/L 時分別高出13.7%和5.75%。 向培養基中添加80 g/L 的CaCO3時，最高在發酵144 h 后積累（59.7±1.71） g/L的L-蘋果酸， 比CaCO3質量濃度為60 g/L 和100 g/L時分別高出9.69%和5.87%。 在CaCO3質量濃度為80 g/L 時， 葡萄糖消耗比60 g/L 和100 g/L 時分別高出8.53%和1.38%。但是，CaCO3質量濃度為80 g/L時產率最高， 比60 g/L 和100 g/L 時分別提高1.79%和3.64%。 表明CaCO3最優質量濃度為80 g/L。

圖1 氮源對米曲霉形態的影響Fig. 1 Effect of nitrogen source on morphology of Aspergillus oryzae

圖2 CaCO3 質量濃度對L-蘋果酸產量、菌體質量濃度、菌球濃度、菌球直徑和葡萄糖消耗的影響Fig. 2 Effect of concentration of CaCO3 on L-malate production，dry cell weight，pellet number，pellet size diameter and consumption of glucose

2.3 攪拌轉速對米曲霉菌體形態和產酸的影響

以搖瓶發酵優化結果為基礎，本工作研究了30 L 發酵罐中攪拌轉速對A. oryzae菌體形態和L-蘋果酸積累的影響。 當攪拌轉速為200 r/min 時，菌體在發酵罐中呈菌絲狀，當攪拌轉速在400～600 r/min范圍內，A. oryzae主要形成菌球， 隨著攪拌轉速的提高，單位體積發酵液中菌球濃度不斷增加，菌球直徑不斷減小（表2）。 攪拌轉速從400 r/min 提高到600 r/min 時，菌球濃度增加而菌球直徑減小。 攪拌轉速為600 r/min 時V值為（99.3±5.06） mm3/mL，比攪拌轉速是400 r/min 時降低了35.0%。不同轉速攪拌帶來的流體流動與剪切力會顯著影響菌體的形態，攪拌轉速越大，液體流動速度越快，剪切力越大，更利于形成數量多的小直徑菌球。 Park J P 等[16]考察了攪拌強度對蛹蟲草 （Cordyceps militaris） 菌體形態的影響， 研究表明攪拌轉速為300 r/min 時，菌球直徑小并且表面光滑， 但當攪拌轉速為50 r/min時，菌球大而松散。 菌體質量濃度也隨著攪拌轉速的提高而增加， 當攪拌轉速從200 r/min 增加到400 r/min時，菌體質量濃度提高了14.4%。原因可能是隨著攪拌轉速增加發酵液溶氧也不斷增加，從而利于菌體生長導致菌體質量濃度增加。 然而，當攪拌轉速繼續增加到600 r/min 時， 菌體質量濃度并沒有大幅度增加（約19.8 g/L）。 結果如圖3 所示，隨著攪拌轉速的提高，L-蘋果酸的產量也隨之增加， 當攪拌轉速是600 r/min 時， 最高積累83.0 g/L 的L-蘋果酸， 比攪拌轉速是200 r/min 和400 r/min 時分別提高了63.4% 和31.5%； 葡萄糖消耗比攪拌轉速是200 r/min 和400 r/min 時分別提高了24.1%和17.0%，產率比攪拌轉速是200 r/min 和400 r/min 時分別提高了31.4%和12.2%。 結果表明高攪拌轉速促進A. oryzae生長， 增加葡萄糖消耗和L-蘋果酸積累，最佳攪拌轉速是600 r/min。 在絲狀真菌發酵過程中， 在菌體形態和攪拌轉速之間有一種最優的狀態，在這種情況下，攪拌可能也會對細胞的氧氣供應進行調節[17]。

圖3 攪拌轉速對L-蘋果酸產量， 菌體質量濃度和葡萄糖消耗的影響Fig. 3 Effect of agitation speed on L-malate production,dry cell weight and consumption of glucose

表2 攪拌轉速對菌體形態的影響Table 2 Effect of agitation speed on the morphology of Aspergillus oryzae

2.4 通氣對米曲霉菌體形態和產酸的影響

通氣條件同樣是影響發酵罐中溶氧水平的一個重要因素，因此進一步研究了通氣條件對A. oryzae菌體形態和產酸的影響。 如圖4 所示，隨著通氣量增加，單位體積發酵液菌球數量不斷增加，通氣量為3 vvm 時單位體積發酵液菌球濃度為（273±6） 個/mL，比通氣量為1 vvm 和2 vvm 時分別高出46.0%和8.76%。 通氣從1 vvm 提高到2 vvm 時菌球直徑從0.997 mm 降低為0.834 mm。 當通氣量為3 vvm 時，菌球直徑沒有進一步縮小（約0.832 mm）。 此外，通氣量為2 vvm 時，V 值比1 vvm 和3 vvm 時分別降低23.1%和10.2%。 菌體質量濃度隨著通氣量的提高也不斷增加，結果見圖4（b）， 通氣量為3 vvm 最大菌體質量濃度為33.6 g/L，比通氣量為1 vvm 和2 vvm 分別高出69.8%和14.7%。 通氣量為2 vvm時，L-蘋果酸產量比1 vvm 和3 vvm 時分別提高32.5%和21.9%。 但是，葡萄糖消耗并沒有隨著通氣量的改變而發生明顯變化（～180 g/L），這表明增加通氣并不能促進葡萄糖消耗。 當通氣量為2 vvm時， 產率比1 vvm 和3 vvm 時分別提高34.8%和26.5%。因此，最適通氣量為2 vvm。結果表明氧氣的傳遞是影響L-蘋果酸在發酵罐中積累的一個重要因素，同樣的現象也存在于葡萄糖酸發酵過程中[9]。

圖4 通氣量對L-蘋果酸產量、菌體質量濃度、菌球濃度、菌球直徑和葡萄糖消耗的影響Fig. 4 Effect of aeration rate on L-malate production，dry cell weight，pellet number，pellet size diameter and consumption of glucose

2.5 米曲霉形態對L-蘋果酸產量的影響

菌球形態與細胞代謝關系緊密，單位體積發酵液菌球總體積 （V 值） 與L-蘋果酸產量的關系如（圖5） 所示。 搖瓶上V 值與L-蘋果酸產量的關系是：y=-0.0046x2+1.1307x-0.6498，R2= 0.9897；發酵罐上V 值與L-蘋果酸產量的關系是：y=0.0091x2-2.6346x+253.53，R2=0.9684。 結果表明， 在搖瓶水平，L-蘋果酸產量隨著V 值增加先上升后降低；當V 值在122.9 mm3/mL 左右時，L-蘋果酸產量達到最高（約68.8 g/L）。 原因可能是當V 值低時，菌球個數和菌球直徑的值處于低水平，菌球內部結構疏松密度小不利于菌球生長和產酸， 而當V 值高時，菌球濃度和菌球直徑的值處于高水平，單位發酵液菌球數量增加導致發酵液粘稠，菌球直徑過小導致內部結構致密從而不利于O2和營養物質的傳遞[18]。在乳酸發酵過程中也出現了相似的情況，當菌球密度較低時內部中空不利于產酸， 而當菌球密度大于60 kg/m3時影響傳質抑制產酸[19]。 在發酵罐水平，L-蘋果酸產量隨V 值增加而逐漸降低， 當V 值為76.4 mm3/mL 時，L-蘋果酸產量最高為109.9 g/L。

圖5 搖瓶上V 與L-蘋果酸產量的關系和發酵罐上V 與L-蘋果酸產量的關系Fig. 5 Relationship between the total of pellet in the unit volume fermentation （V） and L-malate production

3結 語

本文通過研究氮源種類、CaCO3質量濃度、攪拌轉速和通氣量對A. oryzae 菌體形態和L-蘋果酸產量的影響，得出最佳營養和環境條件為：胰蛋白胨為氮源，CaCO3質量濃度為80 g/L， 攪拌轉速600 r/min，通氣量2 vvm。以菌球濃度、菌球直徑和單位體積發酵液菌球總體積（V 值） 來表征形態，并研究得出V 值與L-蘋果酸產量的關系。 在30 L 發酵罐中：發酵132 h，菌球濃度251 個/mL，菌球直徑0.834 mm，V 值為76.4 mm3/mL，A. oryzae 消耗177.6 g/L 葡萄糖，L-蘋果酸質量濃度達到109.9 g/L，產率為0.62 g/g，生產強度達到0.83 g/（L·h）。