Toll樣受體4與KDM2B在卵巢癌組織中的表達及其臨床意義

楊慧蘭 易葉葉 侯海瑞 蘇善恒 譚彩春 況燕△

(1.廣西醫科大學第一附屬醫院婦產科，廣西 南寧 530021；2.長沙醫學院附屬第一醫院婦產科，湖南 長沙 410005)

卵巢癌是女性生殖系統三大惡性腫瘤之一，死亡率居婦科腫瘤之首[1]。由于腫瘤的生物學特性和卵巢的位置，在早期診斷該病一直很困難，確診卵巢癌時大多數患者已為晚期[2]。因此研究影響卵巢癌的發生發展的機制，尋找卵巢癌早期診斷及治療的新靶點是我們刻不容緩需要解決的問題。Toll樣受體4(TLR4)及KDM2B均在腫瘤的發生發展過程中起著不同程度的作用，但兩者之間關系在卵巢癌的研究中未見報道。本研究采用免疫組化法檢測TLR4及KDM2B在不同卵巢組織中的表達情況，分析兩者之間的相互關系以及與卵巢癌臨床病理特征的相關性，為卵巢癌發生發展的機制研究奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1研究對象 收集2017年12月至 2019年9月在廣西醫科大學第一附屬醫院進行診治的100例卵巢疾病患者的卵巢組織標本，包括20例正常卵巢組織(來源于患子宮肌瘤或子宮腺肌病行全子宮雙附件切除術的患者)，25例良性卵巢腫瘤組織(14例粘液性囊腺瘤，11例漿液性囊腺瘤)，55例卵巢癌組織(30漿液性腺癌、22例黏液性腺癌，3例透明細胞癌)。所有病例在取材前均未接受藥物、放療等特殊治療，并經過組織病理學檢查明確診斷。本研究經醫院倫理委員會批準。

1.2主要試劑 TLR4兔多克隆抗體(Abcam公司，批號：ab13556)KDM2B兔多克隆抗體(SAB公司，批號：47690)，SP試劑盒(博士德生物公司，批號：SV0002)和DBA顯色試劑盒(博士德生物公司，批號：AR1022)。

1.3實驗方法 應用免疫組化SP法分別檢測正常卵巢組織、良性卵巢腫瘤組織、卵巢癌組織中TLR4及KDM2B的表達情況，實驗過程嚴格按照試劑使用說明書進行。其中TLR4及KDM2B抗體的工作液濃度分別為 1∶1 000、1∶200，以磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照，以已知陽性切片作為陽性對照。最終在顯微鏡下觀察結果。

1.4結果評定標準 TLR4與KDM2B陽性定位分別是細胞膜及細胞核，故在細胞膜或細胞核內出現棕黃褐色顆粒定義為陽性表達。在400倍高倍鏡下，每張切片均隨機取5個視野，每個視野根據染色強度計分和陽性細胞百分比。染色程度評定：不著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細胞百分比評定： <25% 為1分，25%～50% 為2分，50%～75%為3分，>75%為4分。最后將染色程度和陽性細胞百分比相乘作為最終判定結果：0分為陰性(-) ，1～4 分為弱陽性( + )，4～8分為中度陽性( + + )，8～12 分為強陽性 ( + + + )。其中( + ) 、( + + ) 、( + + + ) 均為陽性表達。

1.5統計學方法 采用SPSS 25.0軟件進行統計學分析。計數資料以n(%)表示，采用χ2檢驗；采用 Spearman相關系數進行相關性分析；以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1TLR4及KDM2B在不同卵巢組織中的表達情況 免疫組化結果顯示，卵巢癌中TLR4及KDM2B陽性表達率均明顯高于良性卵巢腫瘤組織和正常卵巢組織(P均<0.05)。見表1、圖 1。

表1 TLR4和KDM2B在不同卵巢組織中的表達情況[n(%)]

注:A、B、C分別為TLR4在正常卵巢組織、良性卵巢腫瘤組織及卵巢癌組織中的表達情況；D、E、F分別為KDM2B在正常卵巢組織、良性卵巢腫瘤組織及卵巢癌組織的表達情況。圖1 TLR4和KDM2B分別在不同卵巢組織中的表達情況(DAB染色，×400)

2.2TLR4及KDM2B陽性表達情況與卵巢癌臨床病理學特征的關系 TLR4及KDM2B在低分化卵巢癌組織中陽性表達率均較高分化卵巢癌組織高(P<0.05)，且隨著國際婦產科協會(FIGO)分期的增加而升高(P<0.05)，其中有淋巴結轉移者表達陽性率較高(P<0.05)。兩者的陽性表達率與年齡無關，差異無統計學意義(P>0.05) 。見表2。

表2 TLR4及KDM2B陽性表達與卵巢癌患者臨床病理學特征的關系[n(%)]

2.3TLR4與KDM2B在卵巢癌中表達的相關性分析 在卵巢癌組織中TLR4與KDM2B的表達呈正相關(r=0.310，P=0.021<0.05)。

3 討 論

Toll樣受體(TLRs)是一種進化保守的膜結合蛋白，廣泛表達在免疫細胞表面。TLRs在真核生物的免疫、神經發生和發育過程中起著重要作用[3]。TLR4作為TLR家族的一員，主要在免疫細胞中表達，并且在先天和獲得性免疫中發揮著重要作用[4]。Y.Li等[5]研究發現，TLR4激活在多個位點誘導組蛋白甲基化變化，其中KDM3A通過參與TLR4對肺腺癌細胞Foxp3轉錄的調控，促進抑制細胞因子的分泌，從而促進肺癌細胞的免疫逃逸，揭示了表觀遺傳組蛋白甲基化在肺癌細胞免疫逃逸調控中的重要作用。TLR4也在胃癌、腸癌等多種腫瘤組織和細胞中呈高表達，并起到促進腫瘤生長、轉移和免疫逃逸的作用[6-7]。本研究通過免疫組化法檢測TLR4在不同卵巢組織中的表達，結果顯示TLR4在卵巢癌組織中的表達均高于良性卵巢腫瘤和正常卵巢組織(P<0.05)，且TLR4的表達陽性率隨著腫瘤組織分級及 FIGO 分期的增加而升高(P<0.05)， 存在淋巴結轉移者TLR4的表達陽性率較高(P<0.05)，這一結果與G.Vlad等[8]結果相似，提示TLR4可能在卵巢癌的發生發展過程中起著重要作用。

KDM2B(也稱為NDY1、FBXL10、JHDM1B和CxxC2)，是JHDM (jmjc domain-containing histone demethylase)家族的成員之一[9]。它是一種普遍存在的核蛋白，對H3K36me2和H3K4me3 進行脫甲基[10-11]。KDM2B具有抑制細胞衰老，防止細胞分化，促進細胞增殖和遷移，調節干細胞自我更新等多種生物學作用[12]。研究[13-14]發現KDM2B的過表達促進了MoMuLV誘導的T細胞淋巴瘤，急性淋巴細胞白血病(ALL)和急性骨髓性白血病(AML)的進展。敲除ALL、慢性髓細胞白血病和AML細胞系中的KDM2B，不僅減少了細胞生長，而且減少了小鼠的肺轉移。KDM2B在基底樣三陰性(ER-，PR-和Her2-)乳腺癌中高表達，并與其不良預后有關[15]。A.Tzatsos等[16]研究表明KDM2B激活MYC和KDM5A基因的表達從而促進胰腺癌的進程，其直接作用于MYC啟動子，進而抑制胃癌的糖酵解.KDM2B可通過增加EMT促進轉錄因子的表達，從而膀胱癌的細胞增殖，遷移，血管生成和癌癥干細胞自我更新[17]。此外，KDM2B可以通過激活PI3K/mTOR途徑促進鼻咽癌的進展[18]。綜上說明KDM2B在多種腫瘤的發生發展過程起著重要作用。本研究結果顯示KDM2B在卵巢癌組織中的表達均高于良性卵巢腫瘤及正常卵巢組織(P<0．05)，KDM2B的表達陽性率隨著腫瘤組織分級及 FIGO 分期的增加而升高(P<0．05)，存在淋巴結轉移者KDM2B的表達陽性率較高(P<0.05)，與Y.Kuang等[19]研究結果相似，提示KDM2B的高表達影響卵巢癌的發生發展。并且研究結果顯示TLR4與KDM2B在卵巢癌中的表達呈正相關，由此我們推測TLR4與KDM2B可能一同參與了卵巢癌的發生發展。

綜上所述，在卵巢癌組織中TLR4與KDM2B均呈高表達，兩者在卵巢癌發生發展中的具體作用機制可能不同。其中TLR4激活時在多個位點誘導組蛋白甲基化變化，而KDM2B是一種去甲基化酶，那么KDM2B是否在TLR4激活時參與卵巢癌的發生發展過程則有待深入研究。這將拓展卵巢癌的發生發展機制研究范疇，為卵巢癌的臨床治療提供新思路。