MMP-2、MMP-9在系統性硬化病小鼠模型中的表達及意義

陶志清 雷玲 魯伊 鄭樂婷文靜 李晞 趙鋮△

(廣西醫科大學第一附屬醫院，(1.風濕免疫科；(2.檢驗科，廣西 南寧 530021)

系統性硬化病(SSc)是一種多系統疾病，以皮膚、肺、腎臟、胃腸道和心臟大量沉積膠原蛋白和其他結締組織成分為特征。免疫系統失調和自身抗體的產生導致血管內皮和肺泡上皮細胞損傷導致組織的纖維化，組織纖維化反映了膠原蛋白產生和降解之間的不平衡，細胞損傷和異常愈合導致細胞外基質(ECM)蛋白特別是膠原蛋白在不同器官的積累[1]。ECM的過度沉積導致組織纖維化，損害組織結構和器官功能，組織中ECM蛋白的數量是通過基質金屬蛋白酶(MMPs)對其產生和降解的平衡來控制的[2]。MMPs按其結構域可分為膠原酶、明膠酶、基質蛋白酶、母系蛋白酶和膜型基質金屬蛋白酶。MMP-2(明膠酶A)和MMP-9(明膠酶B)是MMPs家族的著名酶，對膠原有廣泛的底物特異性。MMP-2和MMP-9對原纖化膠原在最初被膠原酶裂解后的降解有相當大的影響，這兩種明膠酶具有膠原蛋白水解活性，并能夠裂解其他幾種ECM蛋白[3]。因此，明膠酶在纖維化疾病的ECM穩態和發病機制中起著重要的作用。本研究通過檢測博萊霉素誘導的SSc小鼠模型皮膚、肺組織中MMP-2、MMP-9的表達量，分析MMP-2、MMP-9改變在SSc發生中的可能機理，為其治療及預后提供新的途徑和方法。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF級雌性BALB/c小鼠16只，體重25 g左右，6～8周齡，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，自由飲水、攝食，適應性喂養1周。所有實驗方案及操作均符合實驗動物倫理學要求。

1.2主要實驗試劑 Thal(常州制藥廠)，BLM(浙江海正藥業股份有限公司)，HYP測試盒( 南京建成生物研究所) ，引物(上海生工生物公司)，逆轉錄試劑盒、DNA 純化試劑盒、熒光定量PCR試劑(日本TaKaRa 公司)。

1.3方法

1.3.1動物建模及分組 將16只雌性BALB/c小鼠隨機分對照組與SSc組，每組8只，硫化鈉溶液脫去小鼠背部中央的毛，約2.0 cm×2.0 cm。對照組于小鼠背部脫毛處中央區皮下注射PBS 0.1 mL，SSc組注射用1 mg/mL的博來霉素0.1 mL， 1次/d，連續注射3周后處死，取背部皮膚和肺進行檢測。

1.3.2HE染色和Masson染色 取小鼠的皮膚、肺組織進行固定、脫水、石蠟包埋，切片，行HE染色和Masson染色，測量鏡下小鼠皮膚的厚度，皮膚和肺部炎癥的程度：0表示無；1表示少許；2表示輕度；3表示中度；4表示重[4]。隨機選擇切片區域，由兩位病理科醫生進行盲法閱片，按照Ashcroft 半定量進行纖維化程度評分[5]。

1.3.3羥脯氨酸含量的測定 采用樣本堿水解法，檢測皮膚和肺的HYP含量，按照試劑盒說明書操作。

1.3.4熒光定量PCR法(rt-qPCR)檢測MMP-2、MMP-9 mRNA的表達 取小鼠左肺上葉肺組織和背部皮膚各約80 mg，應用柱式法提取總RNA，應用oligo dT引物與random引物搭配進行逆轉錄制備cDNA。應用SYBR GreenI染料法進行熒光定量PCR檢測，以β-actin 為內參照，各樣本均設3個復孔。各引物序列：β-actin：上游5’-ATCCACGAAACTACCTTCAA-3’，下游：5’-CCAAATTGTATTGCAGATGTTCCAC-3’；MMP-2引物上游序列：5’TGGCACCACCGAGGACTATGAC3’，下 游：5’ACACCACACCTTGCCATCGTTG3’；MMP-9引物序列：上游：5’GGAGCACGGCAACGGAGAAG3’，下游：5’CCTGGTCATAGTTGGCTGTGGTG3’。將所得Ct值按照2-ΔΔCt的方法進行處理。

2 結 果

2.1小鼠模型皮膚、肺病理的作用 HE染色和Masson’s染色顯示，對照組小鼠肺泡結構正常，無明顯炎癥細胞浸潤，少量膠原沉積；模型組小鼠可見肺泡結構紊亂，大量炎癥細胞浸潤，肺泡、肺間質及支氣管壁周圍成纖維細胞增多并伴纖維組織增生，膠原明顯增多；SSc組肺部炎癥以及纖維化評分較對照組明顯增加 (P<0.01)。HE染色和Masson染色顯示 ：SSc組小鼠皮膚組織學上基本正常，無明顯炎癥細胞浸潤，少量膠原沉積；SSc組皮損處真皮層明顯增厚，表皮萎縮，真皮層明顯增厚，血管壁增厚、管腔狹窄，并伴有大量炎癥細胞浸潤，膠原纖維增多；SSc組皮膚厚度、炎癥較對照組明顯增加 (P<0.01)。見圖1及圖2。

2.2小鼠羥脯氨酸含量 與對照組相比，模型組皮膚和肺組中HYP含量明顯增加(P<0.05)。見表1。

表1 小鼠皮膚、肺病理及羥脯氨酸含量

2.3小鼠皮膚、肺組織中的MMP-2、MMP-9 mRNA表達 與對照組比較，SSc組小鼠肺組織 MMP-9 mRNA 表達水平增加，(P<0.01)，SSc組小鼠皮膚和肺MMP-2、皮膚MMP-9mRNA 表達水平增加(P<0.05)。見圖3及圖4。

3 討 論

SSc是一種多系統纖維化的自身免疫性疾病。細胞損傷和細胞因子、生長因子及血管生成因子的異常持續產生導致組織修復失調。結締組織穩態是細胞外基質(ECM)的合成和降解之間的平衡。器官組織中ECM成分的過度沉積會導致纖維化，從而破壞器官的功能[1]，而ECM的降解主要受MMPs的調控。本研究結果顯示，HE和Masson染色顯示SSc小鼠皮膚和肺炎癥及纖維化程度增加，膠原增多，皮膚增厚，HYP含量增加，這與我們的前期研究[6-7]結果一致。結果顯示，SSc小鼠皮膚和肺組織中MMP-2、MMP-9 mRNA表達量升高。MMP-2和MMP-9的增加引起基底膜的破壞和成纖維細胞對肺泡的侵襲，從而有利于纖維的形成，MMP-2和MMP-9在特發性肺間質纖維化(IPF)患者中表達升高[8]，這與本研究結果一致。提示MMP-2、MMP-9在SSc的纖維化發生發展起重要作用。伴有間質性肺疾病的SSc(SSc-ILD)患者與無ILD患者和健康對照組相比，支氣管肺泡灌洗液中MMP-9的含量和活性均有所增加[9]。有研究[10]采用明膠酶譜法檢測SSc小鼠肺組織MMP-9活性增加，但是MMP-2并沒有增加，然而在皮膚組織中MMP-2、MMP-9活性增加。C.Meng等[11]研究表明，彌漫性系統性硬化病(dSSc)患者皮膚中MMP-9的表達明顯低于正常組，然而MMP-9水平在局限性系統性硬化病(lSSc)患者皮膚的表達和正常組無明顯差異。這些結果的差異，有待進一步研究探討。

SSc的主要病理特征是纖維化。在研究[12]中，MMP-9的過表達導致減少的纖維化，在另一項研究[13]中認為它是促纖維化的，而研究[14]則認為它沒有作用。就像許多MMPs一樣，MMP-9在纖維化中作用的性質尚無定論。這些結果的差異部分可能是由于病理評估的時間造成的，纖維化過程始于損傷，炎癥，修復和最終消退，后者在纖維化疾病中被破壞，有研究[15]認為，如果MMPs在疾病誘導的早期表達，它們具有促纖維化作用，但在疾病誘導的后期，它們具有抗纖維化作用。顯然，評估MMP-9在纖維化中的免疫調節作用需要進一步深入研究。

MMP-2、MMP-9的表達增加，究竟是機體對博萊霉素的纖維化效應的防御反應，還是這種過表達與博萊霉素的纖維化效應有協同作用，目前尚不清楚。由于明膠酶功能的復雜性、調控機制的復雜性和動物研究的缺乏，MMP-2、MMP-9在SSc中的作用仍有許多未知之處，因此需要進一步的研究。

注：A、B分別為對照組、SSc組小鼠皮膚HE染色；C、D分別為對照組、SSc組小鼠肺HE染色。圖1 小鼠皮膚、肺組織 HE 染色結果(×200)

注：E、F分別為對照組、SSc組小鼠皮膚Masson染色；G、H分別為對照組、SSc組小鼠肺Masson’s染色。圖2 小鼠皮膚、肺組織Masson染色結果(×200)

圖3 兩組小鼠肺MMP-2、MMP-9mRNA相對表達量

圖4 兩組小鼠皮膚MMP-2、MMP-9mRNA相對表達量