基于Label-free技術分析補骨脂二氫黃酮甲醚的肝毒性作用機制

朱 月，王 姍，徐麗嬌，孫曉波，季宇彬，孫桂波*

（1.哈爾濱商業大學藥學院，哈爾濱 150076；2.哈爾濱商業大學藥物工程技術研究中心，哈爾濱 150076；3.中國醫學科學院、北京協和醫學院藥用植物研究所藥理毒理中心，北京 100193）

藥物性肝損傷（DILI）是指在疾病治療過程中，由于藥物或其代謝產物引起的肝細胞毒性損害或肝臟對藥物及代謝產物過敏所致的疾病。DILI可在無肝臟疾病的人群中發生，在已有基礎肝臟疾病的患者中更易發生〔1〕。補骨脂二氫黃酮甲醚（Bavachinin，BVC）是補骨脂乙醇提取物中的一種黃酮類化合物，研究表明其具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、神經保護、治療哮喘及心血管疾病等作用，在藥物開發與臨床應用中價值較大〔2〕。現有研究表明BVC具有明顯的肝細胞毒性〔3〕，但該化合物的肝毒性靶點尚不明確，不利于其開發研究，因此明確其肝毒性靶點至關重要。

非定量法（Label-free）定量蛋白質組學技術是一種非標記的差異蛋白質組學技術，該技術不使用同位素標記物，而是直接根據質譜峰的強度來對肽段或蛋白進行相對定量〔4〕。首先，將提取所得到的蛋白質酶解產生肽段，應用液質聯用技術（LC-MS/MS）對肽段進行分離，然后使用特定軟件檢索原始質譜數據，解析出不同樣本中各個肽段的定量信息，進而獲得在不同樣本中蛋白質的定性和定量信息。該技術的優勢有樣本操作量少，檢測到的低豐度蛋白較多，這些優勢使Label-free定量蛋白質組學技術快速成為近年來重要的質譜定量方法。本研究利用Label-free蛋白質組學技術，Proteome Discover軟件結合uniprot-homo+sapiens20180702_173026.fasta數據庫，系統分析蛋白質組分差異，篩選在BVC作用前后蛋白質組分的變化趨勢，為探索BVC引起肝毒性的關鍵蛋白，進一步研究BVC肝毒性機制提供參考依據。

1 材料與儀器

1.1細胞HepaRG細胞購自上海冠導生物工程有限公司。

1.2藥物與試劑補骨脂二氫黃酮甲醚（批號：161205），純度99.93%，購自上海融禾醫藥科技發展有限公司；碳酸氫銨（Sigma，批號：09830-500G）；尿酸（Sigma，批號：U5378）；Tris（Amresco，批號：0497）；碘代乙酰胺（Vetec，批號：V900335-5g）；二硫蘇糖醇（Genview，批號：CD116-25g）；胰蛋白酶（Promega，批號：V5113）；甲酸（Sigma，批號：94318）；氨水（Sigma，批號：318612）；乙腈（Sigma，批號：34851）；胎牛血清（Gibco，批號：42Q1627K）。

1.3儀器超凈工作臺（上海智成分析儀器制造有限公司，ZHJH-C1115B）；二氧化碳細胞培養箱（美國Thermo Scientific，Heraeus BB15）；倒置熒光顯微鏡（美國Life Technologies，EVOSFL Ima-ging）；高速離心機（Thermo Scientific，Pico 17 Centrifuge）；熱干濃縮儀（Thermo Scientific，SC210A）；電子天平（賽多利斯科學儀器，SQP）。

2 方法

2.1細胞的培養與蛋白質的提取取對數生長期的細胞，用新鮮的完全RPMI-1640培養基將細胞密度調整到2×105個/mL后，接種到HepaRG細胞培養瓶中，每瓶接種5 mL（含細胞1×106個），在二氧化碳培養箱中預培養24 h后，藥物組加入終濃度為6.25μmol/L的BVC作用24 h，對照組加等體積的RPMI-1640培養基作用24 h。

24 h后，收集上清液于離心管中，1 500 r/min離心5 min。每個培養瓶加入1 mL胰蛋白酶，37℃消化5 min，待細胞完全消化后加入含有胎牛血清的培養基終止消化，慢慢吹打細胞至細胞全部脫離瓶壁，收集細胞懸液于離心管中，1 500 r/min離心5 min，倒掉上清液，-20℃存放。采用北京邦菲生物科技有限公司哺乳動物組織總蛋白提取試劑盒提取蛋白。

2.2蛋白酶解首先進行蛋白質定量，然后取60μg定量好的蛋白溶液于離心管中。加入5μL 1 mol/L二硫蘇糖醇溶液混勻，37℃孵育1 h；加入20μL 1 mol/L碘代乙酰胺溶液，混勻后，室溫避光孵育1 h；轉移樣品至超濾管中，離心后棄去上清；加入100μL尿酸至超濾管中，離心后棄去上清，重復2次；加入50 mmol/L碳酸氫鈉100μL，離心后棄去上清，重復3次；更換新收集管，在超濾管中加入胰蛋白酶，按照蛋白和酶50：1的比例加入胰蛋白酶，37℃酶解12～16 h。

2.3質譜分析

2.3.1 毛細管高效液相色譜 每份樣品采用高效液相系統進行分離。樣品由自動進樣器進樣到質譜柱，再經分析柱分離，流速及相關液相梯度見表1。

表1 液相色譜洗脫梯度參數

2.3.2 質譜鑒定 每份樣品經毛細管高效液相色譜分離后用質譜儀進行質譜分析。

2.4數據分析采用Proteome Discoverer 2.1進行數據分析，肽鑒定使用SEQUST搜索引擎與人類蛋白質組數據庫。參數設定：肽質量耐受：±15 ppm；MS/MS耐受性：0；酶解方式：胰蛋白酶；固定修飾：氨基甲基；可變修飾：氧化。

2.5生物信息學分析采用PANTNER對鑒定出的差異蛋白進行生物學分析，對表達差異蛋白進行蛋白功能富集與分析。通過KEGG通路數據庫對差異蛋白所在的信號通路進行分析與篩選。

3 結果

3.1蛋白濃度測定通過測定樣品吸光度，利用考馬斯亮藍（Bradford）法標準曲線計算出樣品蛋白濃度。見表2。

表2 樣品蛋白濃度

3.2 HepaRG細胞加入BVC前后差異表達蛋白經鑒定共有差異蛋白372個，其中上升趨勢蛋白有170個，下降趨勢蛋白有202個。見圖1。采用兩組樣本間的蛋白質表達差異倍數（FC）和t檢驗得到的P值兩個因素共同繪制火山圖，用于顯示兩組樣本數據的顯著性差異。

圖1 差異蛋白火山圖

3.3差異蛋白生物過程分析經數據庫搜索共得出差異蛋白372個，蛋白生物過程表明蛋白質組分富集于RNA的加工和修飾、細胞周期調控、細胞分裂、染色體劃分、細胞防御機制、信號傳導機制、能源生產和轉換、碳水化合物轉運和代謝、脂質轉運和代謝、輔酶轉運和代謝、氨基酸轉運和代謝、核苷酸轉運和代謝等生物過程。見圖2。

3.4差異表達蛋白GO分析對鑒定出的372個差異蛋白進行GO分析，結果表明：參與生物過程的蛋白分別涉及代謝過程、細胞過程等，參與細胞組成的差異表達蛋白分別位于細胞連接部、細胞外區部、膜部等，參與分子功能的蛋白分別涉及結合物受體活性、催化活性、分子功能調節劑、分子換能器活性、結構分子活性等。見圖3。

3.5差異表達蛋白信號通路鑒定與分類KEGG通路分析表明，差異蛋白共涉及30條信號通路。其中代謝途徑與氨基酸降解途徑所涉及的差異蛋白較多。見圖4。

圖2 差異蛋白生物過程分析

圖3 差異表達蛋白GO分析

圖4 KEGG通路

4 討論

肝臟在異體生物化合物的轉化和代謝中具有重要作用，異體生物化合物的轉化和代謝反過來又可導致肝臟出現各種并發癥〔5〕。藥物引起的肝毒性是近年來的研究熱點之一，在新藥的研發中肝毒性的研究也十分重要。所以明確藥物導致肝損傷的作用機制十分重要。

本研究應用Label-free高通量蛋白質組學分析技術，比較在HepaRG細胞經BVC處理前后蛋白質組分的差異變化。結果表明，獲得的差異蛋白共有372個，其中上升趨勢蛋白170個（P≤0.05，FC≥1.500），下降趨勢蛋白202個（P≤0.05，FC≤0.667）。然后，在上升和下降趨勢表達蛋白中篩選出變化較大的前十名蛋白進行分析。結果表明，這20種蛋白所作用的生物過程各不相同。在上升趨勢蛋白中，GPC1的FC值最高，變化趨勢最明顯。GPC1蛋白能夠與銅離子、成纖維細胞生長因子、肝素硫酸多糖以及層粘連蛋白結合。且研究發現GPC1基因可通過調節PTEN/Akt/β-Catenin通路促進食管鱗狀細胞癌細胞的侵襲式增殖〔6〕。同時GPC1基因也是直腸癌、胰腺癌、食管鱗狀細胞癌的特異性標志物以及治療靶點〔7-8〕。因此，我們推測BVC可能誘導GPC1基因的高表達影響細胞中AKT、AMPK、EGFR等通路，從而影響細胞的遷移與生長而導致肝細胞毒性。下降趨勢蛋白中UPF2的變化趨勢較明顯，UPF2蛋白與細胞核mRNA的輸出有關〔9〕。mRNA又稱信使RNA，是攜帶遺傳信息在蛋白質合成時充當模板的RNA〔10〕。蛋白質是生命的物質基礎，是生命活動的主要承擔者，沒有蛋白質就沒有生命。機體中的每一個細胞和所有重要組成部分都有蛋白質參與〔11〕。而UPF2蛋白的表達下降可導致mRNA的輸出降低從而影響蛋白質的合成。蛋白質的合成降低，細胞無法進行正常的生命活動從而導致肝損傷。所以我們推測BVC引起UPF2蛋白的表達下降，導致mRNA的輸出降低，蛋白質合成減少，從而導致肝損傷。

在差異蛋白的生物過程分析中，我們發現其中有10種蛋白與翻譯、核糖體結構與生物發生有關（Q09028、Q9Y2P8、Q08257、Q8NBN7、Q15293等），6種蛋白與RNA的加工和修飾有關，13種蛋白與翻譯有關（Q8WUD1、Q02127、O95363、P53597、Q96SI9等），10種蛋白與翻譯后的修飾和蛋白質的逆轉有關（Q9BTZ2、Q5TDH0、Q96GQ7、Q8TDD1、O14578等），11種蛋白與脂質轉運與代謝有關（P33908、Q9Y383、P11047、Q8WVC0、Q9NZL4等）。表明BVC可能通過調節RNA的加工和修飾、蛋白質的翻譯與轉錄，以及翻譯后的修飾和蛋白質的逆轉從而影響脂質的轉運與代謝。脂質在體內承擔的主要責任是氧化供能，機體的能量倉庫是脂肪組織，脂肪也能協同皮膚、骨骼、肌肉保護內臟，防止體溫散發和幫助食物中脂溶性維生素的吸收。脂質代謝紊亂是指由于先天或后天因素造成的血液及其他組織器官中脂質及其代謝產物質和量的異常〔12〕。所以我們推測BVC可能通過降低脂質的轉運與代謝能力，導致細胞代謝紊亂而產生肝細胞毒性。

在進行了差異蛋白的GO分析后，本研究又進行了KEGG通路分析，分析發現位于代謝通路的差異蛋白最多，其中上升趨勢蛋白有17個，下降趨勢蛋白有41個。代謝途徑是指在生物體內由酶催化的一連串在細胞內發生的化學反應，形成使用或儲存的代謝物，從而保持細胞內環境的穩態。代謝途徑是維持細胞穩定良好生長非常重要的一條通路，代謝紊亂可引起身體的各種疾病，例如糖尿病由糖代謝紊亂引起，高脂血癥由脂代謝紊亂引起，痛風由尿酸代謝紊亂引起等等。所以維持代謝的穩定十分重要〔13〕。而我們的研究結果表明BVC可引起代謝通路中大量基因的改變，所以我們推測BVC所誘導的肝損傷是由于代謝通路中基因的改變從而導致代謝紊亂而引起的。

BVC藥理作用廣泛，開發研究的價值較大，所以明確其肝毒性機制更利于其開發研究。本實驗利用Label-free高通量蛋白質組學分析技術與KEGG信號通路分析技術研究推測BVC可能通過影響代謝通路中的某些基因而導致細胞代謝紊亂從而引起肝毒性。但BVC具體作用于哪些基因與通路還有待進一步驗證。