黃海希瓦氏菌胞外產物特性研究

吳秋仙，劉學偉

（1.鹽城市亭湖區水產技術推廣站，江蘇 鹽城 224001；2.江蘇長壽集團南山飼料有限公司，江蘇 鹽城 224001）

革蘭氏陰性菌的胞外產物是病原菌的主要保護性抗原，與細菌的致病性及免疫保護性密切相關[1-2]。胞外產物（ECP）是病原菌在生長與繁殖過程中不斷向環境中釋放出的代謝產物。這些代謝產物對于細菌吸收營養物質、吸附和入侵宿主機體、在宿主體內擴散、繁殖以及抵抗宿主免疫因子的免疫作用等具有極為重要的作用。而有些胞外產物可以直接破壞宿主機體的體質，引起宿主的發病甚至死亡，如胞外蛋白酶、溶血素、細胞毒素等，胞外產物成為決定病原菌毒力的重要因素之一。目前已發現副溶血弧菌[2]、嗜水氣單胞菌[3]、遲緩愛德華氏菌[4]等多種水產動物病原菌的胞外產物具有明顯的致病性。胞外酶具有多種酶活性，如明膠酶、酪蛋白酶、卵磷酯酶、脂肪酶、淀粉酶、幾丁質酶等，對宿主產生不同的作用和影響。

宋亞雄等[5]通過感染試驗，證實黃海希瓦氏菌AP629致仿刺參全部死亡。為探討菌株AP629的致病因素，該文通過平板玻璃紙法提取黃海希瓦氏菌AP629的胞外產物，對其進行了特性分析，為揭示黃海希瓦氏菌胞外產物的生物學特性積累了基礎資料，為進一步解析菌株AP629發病機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

黃海希瓦氏菌（Shewanella smarflavi AP629）分離于大連地區患“化皮病”的仿刺參，由該實驗室證實為病原菌，-80℃保存。黃海希瓦氏菌參考菌株（S.marisflavi）KCCM41822由韓國釜慶大學疾病預防實驗室贈送。

1.2 胞外產物的制備

用平板玻璃紙法[1]制備ECPs。將黃海希瓦氏菌AP629接種于營養肉湯培養基，28℃，震蕩培養（180 r/min）24 h，取0.2 mL液體培養物涂布于預先放置一層滅菌玻璃紙的營養瓊脂平板上，28℃培養24 h。每平板用3 mL磷酸鹽緩沖液（PBS，0.01M pH值7.2）洗下菌體，收集菌懸液，于4℃ 14 000 r/min，離心20 min，取上清液，經 0.45 μm 和 0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌或加入慶大霉素（終濃度2 g/L）過夜除菌，離心除去殘渣即為胞外產物提取液。平板涂布培養，證實無菌生長后，低溫保存備用。

每次使用前用紫外吸收法[6]測定其蛋白質總量，測定公式為

ρ（蛋白質）（mg/mL）=（1.5×A280-0.75×A260）×稀釋倍數。

1.3 胞外產物中蛋白相對分子量的測定

采用解離非連續緩沖系統垂直板電泳[7]將胞外產物與電泳樣品緩沖液等體積混勻，煮沸5 min，冷卻后加樣，每孔加20 μL樣品，并加點Marker（Sigma，SDS-6H）。采用Tris甘氨酸（Gly）電泳緩沖液，4℃條件電泳。丙烯酰胺濃度：分離膠10%（v/v），濃縮膠4.75%（v/v）。濃縮膠部分恒定電流為30 mA，分離膠部分恒定電流為60 mA。電泳結束后，凝膠經考馬斯亮藍（CBB）R250（Sigma）染色后用 EPSON PERFECTION 248 PHOTO掃描儀掃描圖片，Gel-Pro Analyzer軟件分析各分離蛋白的相對分子量。

1.4 ECPs中酶的測定

分別配制含量為2 g/L的淀粉、4 g/L酪蛋白、10 g/L脂肪（吐溫-80）、25 g/L卵磷脂平板和營養肉汁明膠，于37℃下過夜，去除水分，將胞外產物的粗提液（30 μL）點樣于預先貼在培養基表面的滅菌雙層濾紙片上（紙片直徑0.5 cm），25℃下放置48 h后觀察結果。脂酶和卵磷脂酶的產生以紙片周圍出現不透明暈圈為陽性；觀察明膠酶的產生時，滴加酸性氯化汞，以紙片周圍出現透明圈者為陽性；觀察淀粉酶的產生時，滴加新配制的Lugol氏碘液，有無色透明圈出現者為陽性[6]。

1.5 ECPs中蛋白酶活力測定

采用《生化技術導論》中的福林試劑法[8]，在37℃下每分鐘水解酪素產生1微克酪氨酸定為一個酶活力單位。按下式計算：

蛋白酶活力單位=（A/15）×F

式中：A為樣品測得光密度查曲線，得相應酪氨酸微克數；F為酶液最終稀釋倍數。

1.6 酶抑制劑試驗

ECPs與一些化學試劑在37℃保溫1 h后，檢測酶活的變化。各種試劑所用濃度見表2。配制時PMSF用丙酮溶解，其他的用蒸餾水溶解。

1.7 ECPs對小白鼠的致病性

分別設置 3個組，1個 ECPs試驗組、1個AP629試驗組，1個對照組，每組8只小白鼠（昆明品系，4周齡雌性）。ECPs試驗組腹腔注射0.05 mL ECPs/只，濃度為2.25 mg/mL；AP629試驗組腹腔注射0.05 mL/只，濃度為108cells/mL；對照組注射相同劑量滅菌PBS（0.01 M，pH值 7.2）。觀察和記錄小白鼠的活動和死亡情況。

1.8 ECPs對仿刺參的致病性

感染用幼參取自大連灣海參養殖場，體質量1～3 g，體長2～5 cm，運回實驗室后在塑料水槽中暫養7 d，每天換水1/3，養殖用水為沙濾海水，水溫11～14℃、pH 值 8.2～8.3、鹽度 31.8、溶氧 8.6±0.3 mg/m3，不間斷充氣。分別設置3個組，1個ECPs試驗組、1個AP629試驗組，1個對照組，每組10頭仿刺參（體長3～4 cm）。ECPs試驗組體腔注射 0.02 mL ECPs/頭；AP629試驗組體腔注射0.02 mL ECPs/頭，濃度為108cells/mL；對照組注射相同劑量滅菌PBS（0.01M，pH值7.2）。記錄仿刺參癥狀和存活情況。

2 結果與分析

2.1 ECPs中蛋白的相對分子量大小

黃海希瓦氏菌AP629和S.marisflaviKCCM41822 ECPs的SDS-PAGE圖譜見圖1。菌株AP629和S.marisflavi KCCM41822 ECPs SDS-PAGE圖譜完全相同。分子量為 114 kDa、66 kDa、39kDa、36 kDa、79 kDa的蛋白條帶是菌株AP629和S.marisflavi KCCM41822共有的。

2.2 ECPs的特性分析

黃海希瓦氏菌AP629作用溫度為25℃時，其ECPs酶比活力為12.52活力單位/mg蛋白。對黃海希瓦氏菌AP629的ECPs進行酶活性檢測，結果表明ECPs具有酪蛋白酶和淀粉酶活性；具有卵磷脂蛋白酶和脂肪酶活性，無明膠酶活性，見表1。

一些金屬離子和化學試劑對病原菌ECPs的酶活的作用見表2。從表 2可看到，當EDTA、PMSF、SDS、MnCl2作用濃度分別為 10、5、5、5 mM 時，ECP酶活受到不同程度抑制；Ca2+和Mg2+則提高ECPs的酶活，可提高3%～19%和12%～28%的酶的活性。

表1 病原菌胞外產物的酶活性

表2 化學試劑對病原菌ECPs活力的影響

2.3 ECPs對小白鼠及仿刺參的致病性

ECPs對小白鼠的致病性，見表3，在每只小白鼠腹腔注射黃海希瓦氏菌AP629的ECPs，試驗20 d期間，小白鼠無任何癥狀出現；菌株AP629試驗組小白鼠全部死亡；對照組沒有出現死亡。

試驗20 d期間，注射黃海希瓦氏菌AP629的的ECPs的仿刺參沒有出現化皮、死亡；注射菌株AP629的仿刺參陸續化皮、死亡；對照組都沒出現任何癥狀。

表3 病原菌ECPs對小白鼠的毒性試驗結果

3 討論

黃海希瓦氏菌是仿刺參的一種條件致病菌，該文對黃海希瓦氏菌AP629的胞外產物進行了特性分析。胞外產物（ECPs）是水產動物病原菌侵染機體的主要成分之一，具有多種酶活性，如蛋白酶、淀粉酶、卵磷脂酶、明膠酶、磷酸酯酶等活性對病原菌的致病性具有重要作用[9-10]。該文研究結果，黃海希瓦氏菌AP629的ECPs具有酪蛋白酶、淀粉酶、卵磷脂蛋白酶和脂肪酶活性，無明膠酶活性。張志強等[11]從大菱鲆分離出的遲鈍愛德華氏菌的ECPs具有淀粉酶活性、脂肪酶活性、卵磷脂酶活性，推測酶活性可能溶解水產動物細胞，為遲鈍愛德華氏菌提供有益的生長環境。Sakai和Ellis[12-13]研究，殺鮭氣單胞菌感染虹鱒后，其ECPs中具有蛋白酶水解膠原蛋白活性，以及殺白細胞素能破壞吞噬細胞，從而引起水產動物發生病理變化。周琳等[14]從患內臟白點病的大黃魚體內分離出變形假單胞菌，其ECPs具有卵磷脂酶活性、胃蛋白酶活性、半胱氨酸蛋白酶等酶活性，并證實與病原菌的毒性有密切關系。

細菌的胞外產物蛋白成分非常復雜，導致蛋白條帶的分子量有很大差異。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）及考馬斯亮藍R-250染色分析表明，黃海希瓦氏菌AP629和參考菌株ECPs蛋白條帶分布在79.0～114.0 kDa。陳雅芳等[15]報道，養殖石斑魚潰瘍病病原哈維氏弧菌ECPs蛋白條帶主要集中在分子質量范圍25.0～66.2 kDa，費辰杰等[16]報道，牙鲆致病菌ECPs蛋白條帶主要集中在分子質量范圍18.0-120.0 kDa。本研究中一些金屬離子和化學試劑對菌株AP629的ECPs的酶活具有一定的影響，當 EDTA、PMSF、SDS、MnCl2作用濃度分別為 10、5、5、5 mM 時，ECP 酶活性受到不同程度抑制；Ca2+和Mg2+則提高ECPs的酶活性，可提高3%～19%和12%～28%的酶的活性。左鳳琴等[17]研究魚源溶藻弧菌當添加了金屬螯合劑50 mmoL/L EDTA和100 mmoL/L苯甲基磺酰氟能分別使ECPs的酶活性下降83.40%和51.32%；曹煜成等[18]研究Zn2+和Mg2+對地衣芽孢桿菌胞外產物酶活性有降低作用。

在本試驗中，腹腔注射黃海希瓦氏菌AP629 ECPs的小白鼠，及體腔注射菌株AP629 ECPs的仿刺參，與對照組一樣，沒有出現任何癥狀，可見黃海希瓦氏菌AP629的ECPs不顯示致病力。張朝霞等[19]研究了副溶血弧菌的胞外產物對中國對蝦具有致病性；賀揚等[20]研究了氣單胞菌感染斑點鮰48 h后，開始出現癥狀并死亡；張志強等[11]和張海月等[21]研究，健康斑馬魚注射遲鈍愛德華氏菌、維氏氣單胞菌均死亡；De la Cruz等[22-24]眾多國外學者用鰻弧菌胞外產物感染日本鱔魚、虹鱒和小鼠后，導致動物腸道普遍發生出血性炎癥反應，肌肉組織受到嚴重損傷，而后陸續死亡。大多數細菌的胞外產物均具有致病性，該文通過對黃海希瓦氏菌AP629的ECPs的研究表明，菌株AP629的ECPs的有無對菌株的致病力可能無影響，確切的致病因子還需進一步研究。