蛙皮素樣肽家族及其受體氨基酸序列信息學比較分析

趙樹林，李璐璐，孫小燕，阿迪萊·艾力，趙紅瓊

(新疆農業大學動物醫學學院，烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】蛙皮素(Bombesin)最早分離于Bombina蛙皮膚，是一種由14個氨基酸組成的多肽，具有促進胃液分泌的作用[1,2]。將與蛙皮素C-端氨基酸具有同源性的多肽稱為蛙皮樣肽(Bombesin-like peptide, BLP)，BLP家族根據其C-端氨基酸的同源性分為蛙皮素、牛蛙肽(Ranatensin)和葉泡雨濱蛙肽(Phyllolitorin)3個亞家族[3]，其氨基酸序列比對見圖1，且所有多肽C-端甲硫氨酸被氨基化(-NH2)。【前人研究進展】蛙皮素亞家族包括蛙皮素、產婆肽(Alytesin)和胃泌素釋放肽(Gastrin-releasing peptide, GRP)。GRP分離于哺乳動物，為27或29個氨基酸序列，具有促進胃泌素分泌的作用，且在哺乳動物還發現了同GRP的C-端10個氨基酸序列完全相同的神經介素C(Neuromedin C, NMC)。牛蛙肽亞家族包括牛蛙肽和分離于哺乳動物的神經介素B(Neuromedin B, NMB)等[4]。NMB具有促進大鼠平滑肌收縮等作用[5]。【本研究切入點】目前，在哺乳動物發現的BLP家族多肽僅有GRP和NMB，用分別通過GRP受體(GRP-R)和NMB受體(NMB-R)起作用[6]，并且2種受體均為7次跨膜(7-Transmembrane, 7-TM)受體[7]。由于動物不同，BLP家族多肽或受體氨基酸序列不同，在進行不同動物BLP家族多肽功能研究或其相應抗體制備過程中，需要關注目的動物BLP氨基酸序列的特異性及其同源性，并進行氨基酸信息學分析比較。針對BLP家族氨基酸信息學分析的文獻僅見Graham團隊對21種動物進行了比較[8]，但其主要對BLP家族全肽(例如：PreproGRP)進行分析，而未關注最終起作用的成熟肽，特別是反芻動物BLP序列與其他動物的不同。【擬解決的關鍵問題】研究比較GRP和NMB 2種多肽激素及其受體的氨基酸序列在不同動物物種間的差異性，特別是牛等反芻動物同其他動物之間的序列差異，并進行生物信息學分析，為在反芻動物進行BLP家族多肽結構和功能研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

通過UniProt數據庫(https://www.uniprot.org/)分別用“GRP”和“NMB”為關鍵詞檢索GRP和NMB及其受體的氨基酸序列，當檢索到同一個物種多個信息數據的時候，標記了“Reviewed(引用)”是首先選擇參考的信息數據。再用“Align(排列)”功能進行牛GRP和NMB多肽或受體蛋白氨基酸序列與其他動物序列差異進行比較。同時，比對了牛GRP-R與NMB-R氨基酸序列，并標明各自7次跨膜區域。

1.2 方 法

用1.1篩選出的不同動物GRP和NMB及它們各自受體全氨基酸序列，通過DNAstar的Megalign 7.1構建GRP和NMB已有全部多肽及受體蛋白氨基酸序列進化樹。

2 結果與分析

2.1 蛙皮素樣肽家族氨基酸序列對比

研究表明,蛙皮素、牛蛙肽和葉泡雨濱蛙肽3個亞家族的不同多肽的氨基酸序列對比，彩色低紋表示高度保守的氨基酸序列，其中C-端甲硫氨酸均被氨基化(-NH2)。圖1

2.2 不同動物GRP氨基酸序列比對

牛(Bovine, UniProt 登錄號Q863C3，下同)27個氨基酸序列的GRP同其它12種不同動物成熟的GRP比對結果見圖2，這12種動物為綿羊(Sheep, P47851)、人(Human, P07492)、豬(Pig, P63153)、豚鼠(Guinea pig, P63152)、狗(Dog, P08989)、虹鱒魚(Rainbow Trout, Q9PS30)、金魚(Goldfish, Q9I8Z9)、馬(Horse, F7DYM4)、小鼠(Mouse, Q8R1I2)、大鼠(Rat, P24393)、雞(Chicken, P01295)、美洲短吻鱷(American alligator, P31886)，其中僅馬和金魚的GRP序列在UniProt中標記為“Unreviewed”，其它均為“Reviewed”。由氨基酸序列比對可知，所列13種動物C-端8個氨基酸序列完全相同，牛、羊、人、豬、豚鼠、狗、虹鱒魚、金魚和馬C-端的10個氨基酸序列(GRP10-27, 即NMC)完全相同，而小鼠、大鼠、雞和美洲短吻鱷C-端10個氨基酸(NMC)完全相同。牛和綿羊的27個氨基酸僅在C-端20位氨基酸不同(分別為甘氨酸和丙氨酸殘基)，其他均相同。圖2

注：灰色底紋表示高度保守的氨基酸殘基
Note: Amino acids with gray background showed highly conserved residues

圖1 蛙皮素樣肽家族氨基酸序列對比
Fig.1 Comparison of amino acid sequence among bombesin- like peptide family

在UniProt中用“BLAST”比較牛GRP氨基酸序列(Q863C3, 134個氨基酸)與其他動物已有的全部序列相似性。牛GRP氨基酸序列與綿羊的最接近，為88.7%；其次為豬和豚鼠，兩者相同為77.8%；與狗、鱘鱒魚、馬、美洲短吻鱷、人、小鼠、大鼠、雞的相似性分別為74.1%、73.7%、72.7%、67.9%、63.7%、63.2%、63.2%、63.0%。用“Megalign”構建進化樹分析GRP已有的全部氨基酸序列顯示，小鼠與大鼠、豚鼠與馬、牛與綿羊、人與狗分別在同一個分支上，而美洲短吻鱷、雞、虹鱒魚和金魚與哺乳類相距較遠。圖3

2.3 不同動物NMB氨基酸序列比對

研究表明,牛(Bovine, Q2T9U8)、人(Human, P08949)、小鼠(Mouse, Q9CR53)、豬(Pig, P01297)、馬(Horse, F7E042)、狗(Dog, J9NU40)、綠猴(Green monkey, A0A0D9RXD7)、恒河猴(Rehsus macaque, H9EYU4)、金倉鼠(Golden hamster, A0A1U7R215)、揚子鱷(Chinese alligator, A0A1U7RLL3)等10種動物成熟的32個氨基酸序列NMB比對情況。牛、人、小鼠和豬GRP在“UniProt”標記為“Reviewed”，其它為“Unreviewed”。NMB氨基酸序列比對結果可知，所列動物C-端10個氨基酸完全相同，而不同區域主要集中在N-端；同時，小鼠與金倉鼠、綠猴與恒河猴NMB的32個氨基酸序列完全一樣。圖4

注：灰色底紋氨基酸殘基表示與牛GRP氨基酸序列比對不同的氨基酸殘基
Note: The amino acids with gray background showed differences compared to bovine GRP

圖2 不同動物GRP氨基酸序列比較
Fig.2 Comparison of GRP amino acid sequences in different animals

圖3 不同動物GRP氨基酸已有全部序列進化樹
Fig.3 Evolution tree of GRP amino acid showed all sequences in different animals

注：灰色背景氨基酸表示與牛NMB氨基酸序列比對不同的氨基酸
Note: The amino acids with gray background show differences compared to bovine NMB

圖4 不同動物32個氨基酸序列的NMB比較
Fig.4 Comparison of 32-amino acid sequence in NMB from different animals

2.4 不同動物GRP-R和NMB-R氨基酸序列比較

用“Megalign”構建GRP-R全氨基酸序列進化樹，包括牛(Bovine, E1BL07)、人(Human, P30550)、小鼠(Mouse, P21729)、大鼠(Rat, P52500)、狗(Dog, E2QTA7)、豬(Pig, K7GR81)、雞(Chicken, Q802E7)、馬(Horse, F7CVR9)、鴨嘴獸(Duck-billed platypus, F7FDW9)、金倉鼠(Golden hamster, A0A1U7QVZ5)、斑馬魚(Brachydanio rerio, E7F6G4)、美洲短吻鱷(American alligator, A0A151NOH2)。在UniProt數據庫僅人(Human, P30550)、小鼠(Mouse, P21729)、大鼠(Rat, P52500)標記為“Reviewed”，其他動物標記為“Unreviewed”。進化樹分析顯示，豬與馬、牛與狗、大鼠與小鼠、雞與美洲短吻鱷分別在同一分支上，而斑馬魚和鴨嘴獸同其它動物相距較遠。“BLAST”分析顯示，與牛GRP-R的氨基酸序列比較相似性最高的為狗(96.1%)，接下來依次為馬、豬、人、金倉鼠、大鼠、小鼠、鴨嘴獸、雞、美洲短吻鱷和斑馬魚，相似性分別為94.3%、94.0%、93.0%、90.9%、90.3%、89.4%、83.9%、82.4%、81.4%和74.9%。圖5

圖5 不同動物GRP-R已有全部氨基酸序列進化樹
Fig.5 Evolution tree of GRP-R amino acid showed all sequences in different animals

研究表明,NMB-R氨基酸序列進化樹，包括牛(Bovine, E1BMN4)、人(Human, P28336)、大鼠(Rat, P24053)、小鼠(Mouse, O54799)、豬(Pig, B2ZI34)、馬(Horse, F6VCY9)、狗(Dog, E2R9E7)、雞(Chicken, E1BRP1)、鴨嘴獸(Duck-billed platypus, F6Y0D2)和熱帶爪蟾(Western clawed frog, F6PHZ7)。在UniProt數據庫中標記為“Reviewed”僅有人、小鼠、大鼠。進化樹分析顯示，牛與豬、小鼠與大鼠分別在同一個分支上，雞、鴨嘴獸和熱帶爪蟾與其它哺乳動物相距較遠。“BLAST”分析顯示，對于牛NMB-R的已有氨基酸序列，相似性最高的為豬，達92.3%；其次為人和馬，分別為91.5%和91.0%；狗、小鼠、大鼠、鴨嘴獸、熱帶爪蟾、雞相似性分別為89.2%、89.0%、88.2%、81.0%，76.3%、72.8%。圖6

圖6 不同動物NMB-R已有全部氨基酸序列進化樹
Fig.6 Evolution tree of NMB-R amino acid showed all sequences in different animals

從UniProt數據庫檢索發現牛GRP-R(E1BL07)和NMB-R(E1BMN4)氨基酸序列長度分別為384和390個，相似性為62.2%。從兩2個受體氨基酸序列比較可知，GRP-R和NMB-R的N-端胞外域分別為1～38和1～48位，C-端胞漿域分別為326～384和328～390位；2種受體7個疏水的跨膜片段氨基酸位置比較相近，但序列有所差異。圖7

注：灰色底紋氨基酸為跨膜區域
Note：Amino acid with gray background means the TM region

圖7 牛GRP-R和NMB-R氨基酸序列比較
Fig.7 Amino acid sequences of the bovine GRP-R and NMB-R

3 討 論

研究通過對不同動物BLP家族2種多肽GRP和NMB氨基酸序列進行比較，結果顯示不同動物成熟的GRP和NMB在C-端具有高度保守性，而在N-端區域變化較大，提示C-端是GRP和NMB的生物活性部位。Zhao等[9]報道，給犢牛注射27個氨基酸的牛GRP和10個氨基酸的NMC(為牛GRP的C-端10個氨基酸的多肽)均可顯著升高血漿生長激素水平，驗證了GRP的生物活性部位在C-端；然而注射NMB卻不能改變犢牛血漿生長激素水平，提示GRP和NMB具有不同的生理功能。目前，公認為GRP與GRP-R親和力高，而NMB與NMB-R親和力高[10]。在大鼠大腦中主要是NMB親和性受體，很少一部分中樞神經系統是GRP親和性受體[11]，在食道平滑肌中存在NMB親和性受體[12，13]，而在胰腺細胞中則是GRP和蛙皮素親和性受體而非NMB親和性受體[14]，提示GRP-R和NMB-R在機體組織定位不同，也反映出他們具有不同的生理功能。

從氨基酸序列分析不同動物GRP或NMB C-端具有高度保守性，例如，反芻動物(牛和羊)與人和鼠的GRP在C-端10個或8個多肽氨基酸序列完全相同。現在市面上銷售的GRP產品主要為人和鼠多肽，因而在進行反芻動物GRP多肽功能研究時，可以選擇人和鼠的GRP多肽用于反芻動物的研究。生物信息學研究表明，不同動物GRP-R和NMB-R氨基酸序列也具有高度保守性但不完全相同，在哺乳動物之間達90.0%，哺乳動物與鳥類為80.0%，可以預測不同動物的GRP或NMB可以交叉使用，但是可能會影響其同相應受體的親和力，進而影響其生物學效率。

GRP-R和NMB-R 2種受體均屬于G蛋白偶聯7-TM受體[7]，在科學研究中需要制備目的動物7-TM受體的抗體時，在設計抗原或半抗原片段時選擇受體膜外區域(非跨膜區域和胞內區域)制備的抗體與受體蛋白發生結合的可能性大，但是需要檢索所選多肽片段同目的動物體內其他蛋白的氨基酸序列相似性，以免制備出的抗體特異性低。研究顯示，牛GRP-R和NMB-R 2種受體相似性僅為62.2%，一方面解釋了它們同內源性配體(GRP和NMB)親和力不同的原因，另一方面，提醒在設計同一目的動物這2種受體的抗原時，要注意其抗原片段相似性。只有2種受體的抗原片段相似性低，制備出的抗體才能特異性地區別這兩種受體。

4 結 論

采用生物信息學分析的方法比較了不同動物(特別是反芻動物牛)BLP家族GRP和NMB及其受體的氨基酸序列的差異性，GRP或NMB多肽C-端氨基酸序列在不同動物之間具有高度的保守性，而其特異性受體(GRP-R或NMB-R)氨基酸序列在哺乳動物之間相似性高達90.0%以上，但牛源這2種受體之間氨基酸序列相似性僅為62.2%，提示其與內源性配體親和性不同。