不同動物糞源葡萄球菌耐藥性調查及耐藥基因檢測分析

楊紫嫣，姚曉慧，馬木爾·阿克木漢，王舒豐，王 凱，夏利寧

(新疆農業大學動物醫學學院，烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】葡萄球菌(Staphylococcus)是革蘭氏陽性菌，形態呈球形或稍橢圓形，因成葡萄串狀，故名。其無鞭毛，無芽胞，多數為非致病菌，少數可致病。含有50多個種及亞種，在自然界中分布廣泛，同時存在于人和動物的皮膚表面以及其鼻、咽和腸道中。葡萄球菌屬于條件性致病菌，是最常見的化膿性球菌，可引起動物的乳房炎，關節炎以及葡萄球菌敗血癥等疾病[1]，給養殖業造成較大損失。【前人研究進展】已有報道表明，在養殖場周圍的環境和空氣中含有許多不同種的葡萄球菌，如：金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、木糖葡萄球菌、松鼠葡萄球菌和科氏葡萄球菌等，其中金黃色葡萄球菌致病力最強且含量最多，占葡萄球菌屬的24%左右，表皮葡萄球菌和腐生葡萄球菌含量次之，且致病力也較低[1]。葡萄球菌可引起多種感染，但引起的呼吸系統疾病占首位(65%)，葡萄球菌是上呼吸道感染的主要病原菌[2]，在動物臨床上，可引起患病動物滲出性皮炎，導致動物生長發育緩慢，嚴重的葡萄球菌感染可引起仔畜死亡，并在畜群中廣泛傳播，引起巨大危害及經濟損失[3]。【本研究切入點】為了提高治療效果或達到預防疾病發生的效果，抗菌藥物廣泛且大量的用于臨床，造成耐藥菌株的數量急速上升[4]，導致通常有效的抗菌藥物失去作用，給臨床治療帶來極大的困難[5]。耐藥葡萄球菌在影響家畜健康的同時也造成環境的污染，也可通過食物鏈將耐藥性傳播給人類，對人類的健康構成威脅[6]。【擬解決的關鍵問題】新疆霍城縣作為新疆伊犁地區重要的畜牧養殖基地，然而有關霍城縣不同動物源葡萄球菌耐藥情況未見報道，耐藥現狀不明，在新疆霍城縣主要規模化養殖場，對不同動物糞源葡萄球菌進行臨床常用抗菌藥物的耐藥調查及相關耐藥基因檢測，獲取的相應數據，指導臨床合理用藥，為新疆霍城地區葡萄球菌耐藥數據庫的建設提供有效依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

2016年10月在新疆霍城縣不同規模化養殖場進行樣品采集。采集豬糞源(長白)100份、羊糞源(阿勒泰)200份、牛糞源(褐牛)198份以及禽糞源(黑羽)300份，共計798份。以金黃色葡萄球菌ATCC29213作為標準質控菌(杭州天和微生物試劑有限公司)。

1.2 方 法

1.2.1 葡萄球菌分離鑒定

從采集的樣品中吸取10 μL置于滅菌的含7.5%氯化鈉營養肉湯中，經37℃恒溫搖床增菌6～8 h后，用接種環蘸取一環增菌菌液在加有亞碲酸鹽卵黃增菌液的Baird-Parker瓊脂平板上劃線接種，倒置于37℃恒溫培養箱中培養24～48 h。葡萄球菌在Baird-Parker瓊脂平板上為灰黑色至黑色有光澤圓形菌落，表面光滑濕潤，挑取可疑單個菌落于1 mL營養肉湯中吹打混勻并增菌后保存備用。對疑似菌株進行革蘭氏染色，選取鏡檢為紫色且呈葡萄串狀排列，無芽孢、無莢膜的菌株，保存備用。同時進行觸酶試驗，挑取已培養18～24 h菌落于玻片上，滴加3%過氧化氫，立即出現氣泡的菌株即為觸酶試驗陽性。確定為葡萄球菌的菌株保菌于60%的甘油肉湯中，-20℃保存并進行后續試驗。

1.2.2 抗菌藥物與培養基

試驗共選用β-內酰胺類、喹諾酮類、酰胺醇類、氨基糖苷類、林可胺類、四環素類和福霉素類7大類10種抗菌藥物進行藥物敏感性試驗。

抗菌藥物：阿莫西林/克拉維酸(Amoxicillin/Clavulanic Acid，A/C)、頭孢噻呋(Ceftiofur，EFT)、苯唑西林(Benzene，OX)；氧氟沙星(Levo-floxacin，DF)；氟苯尼考(Florfenicol，FFC)；阿米卡星(Amikacin，AMK)、慶大霉素(Gentamicin，GEN)；克林霉素(Clindamycin，CM)；四環素(Tetracycline，TE)和利福平(Rifampicin，RP)。(購自中國獸藥監察所)。

培養基：MH肉湯(Mueller-Hinton Broth)，瓊脂粉培養基(均購自北京奧博星生物技術有限公司)；BP(Baird-Parker)瓊脂平板基礎，亞碲酸鹽卵黃增菌液(均購自青島高科技工業園海博生物技術有限公司)；氯化鈉(購自天津市光復科技發展有限公司)。

1.2.3 藥物敏感性試驗

試驗采用歐盟藥敏試驗標準委員會(EUCAST)[7]推薦的瓊脂稀釋法操作程序，檢測葡萄球菌對上述10種抗菌藥物的最小抑菌濃度(Minimal Inhibitory Concentration，MIC)值，根據CLSI的標準進行結果的判定。(金黃色葡萄球菌ATCC29213為質控菌株)。

1.2.4 耐藥基因檢測

DNA模板制備方法如下：對純化后的葡萄球菌重新在BP瓊脂平板上劃線接種，37℃恒溫培養箱培養24～48 h后，刮取1～2接種環菌苔加入50 μL TE中，100℃煮沸10 min，12 000 r/min離心10 min，取上清作模板，-20℃保存備用。

進行5類7種耐藥基因的檢測，包括：β-內酰胺類的mecA和femA耐藥基因、四環素類的tetA基因、喹諾酮類的norA基因、酰胺醇類的cfr和fexA基因，以及林可胺類的ermB基因。PCR產物經1.0%瓊脂凝膠電泳后，PCR產物送上海生工生物工程股份有限公司進行測序，獲取的序列利用NCBI網站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的BLAST程序進行比對。耐藥基因的引物序列。表1

2 結果與分析

2.1 葡萄球菌分離鑒定

研究共采集不同動物糞源共計樣品798份，共分離出葡萄球菌554株，葡萄球菌總體分離率為69.4%。其中，采集豬糞源樣品100份，分離葡萄球菌48株，分離率為48.0%；采集牛糞源樣品198份，分離葡萄球菌127株，分離率為64.1%；采集羊糞源樣品200份，分離葡萄球菌116株，分離率為58.0%；采集雞糞源樣品300份，分離葡萄球菌263株，分離率為87.7%。表2

2.2 不同動物源葡萄球菌MIC

研究表明,豬糞源葡萄球菌對阿米卡星、慶大霉素、阿莫西林/克拉維酸、氟苯尼考、氧氟沙星、利福平、頭孢噻呋、克林霉素、四環素、苯唑西林10種抗菌藥物的耐藥率依次為3.0%、22.7%、30.3%、43.9%、59.1%、63.6%、66.7%、74.2%、83.3%、84.8%。其中氧氟沙星、利福平、頭孢噻呋、克林霉素、四環素、苯唑西林耐藥率均超過50%。

雞糞源葡萄球菌對阿米卡星、阿莫西林/克拉維酸、利福平、慶大霉素、氧氟沙星、頭孢噻呋、氟苯尼考、克林霉素、苯唑西林、四環素10種抗菌藥物的耐藥率依次為7.4%、17.8%、35.2%、40.3%、41.6%、44.0%、79.5%、88.9%、91.9%、93.0%。氟苯尼考、克林霉素、苯唑西林、四環素耐藥率均超過75%。圖1

圖1 不同動物糞源葡萄球菌的耐藥率
Fig.1 Resistance rate ofStaphylococcusin different animals

表1 被檢耐藥基因的擴增引物序列及片段長度Table 1 Primer sequences and amplification fragment length of the resistant gene

表2 不同動物糞源的葡萄球菌分離結果Table 2 Separation of Staphylococcus from different animals

羊糞源葡萄球菌對慶大霉素、阿米卡星、氟苯尼考、氧氟沙星、阿莫西林/克拉維酸、四環素、頭孢噻呋、利福平、克林霉素、苯唑西林10種抗菌藥物的耐藥率依次為4.2%、15.6%、19.3%、44.8%、45.3%、50.5%、53.1%、53.1%、67.7%、72.9%。

牛糞源葡萄球菌對氟苯尼考、阿莫西林/克拉維酸、四環素、克林霉素、氧氟沙星、利福平、頭孢噻呋、苯唑西林8種抗菌藥物的耐藥率依次為1.4%、2.9%、7.2%、11.6%、32.6%、33.3%、34.1%、59.4%。牛糞源葡萄球菌對阿米卡星和慶大霉素均100%敏感。牛糞源葡萄球菌整體耐藥情況比其他3種動物糞源葡萄球菌耐藥情況較輕。圖1

2.3 不同動物糞源葡萄球菌多藥耐藥結果

研究表明,雞糞源葡萄球菌主要以4耐(24.8%)和5耐(25.2%)為主，占50%，且有9株菌對被檢的10種抗菌藥物全部耐藥；豬糞源葡萄球菌以5耐(13.6%)、7耐(16.7%)和8耐(18.2%)為主，占48.5%；羊糞源葡萄球菌主要以1耐(12.5%)、2耐(12.5%)、5耐(12.5%)和8耐(13.5%)為主，占51.0%；牛糞源葡萄球菌以0耐(23.2%)、1耐(26.8%)和3耐(22.5%)為主，占72.5%。圖2

圖2 不同動物糞源葡萄球菌的多藥耐藥率比較
Fig.2 Comparison of multidrug resistance rates of Staphylococcus from different animals

2.4 不同動物糞源葡萄球菌耐藥基因檢測結果

用PCR方法檢測5大類7種耐藥基因檢測結果顯示。豬糞源葡萄球菌和雞糞源葡萄球菌檢出率最高的是ermB，檢出率分別是70.8%和93.5%；羊糞源葡萄球菌和牛糞源葡萄球菌檢出率最高的是femA，檢出率分別是22.4%和17.3%。圖3

圖3 不同動物糞源葡萄球菌的耐藥基因檢測
Fig.3 Staphylococcus resistance gene detection in different animals

3 討 論

3.1 不同動物糞源葡萄球菌耐藥情況

研究結果顯示，豬源菌對四環素、氧氟沙星、頭孢噻呋、苯唑西林、利福平、克林霉素6種抗菌藥物耐藥率超過50%。雞源菌對四環素、苯唑西林、氟苯尼考、克林霉素4種抗菌藥物的耐藥率超過50%，且雞源菌對四環素和苯唑西林的耐藥率超過90%。羊源菌對四環素、頭孢噻呋、苯唑西林、利福平、克林霉素5種抗菌藥物耐藥率超過50%。而牛源菌僅對苯唑西林一種抗菌藥物的耐藥率超過50%。耐藥程度由高到低依次為豬糞源葡萄球菌>雞糞源葡萄球菌>羊糞源葡萄球菌>牛糞源葡萄球菌。豬糞源葡萄球菌對被檢抗菌藥物耐藥最嚴重，結合采樣發現，當今豬場集約化養殖是現代畜牧業發展的方向，但是很多養殖戶其設施設備還未達到標準化的要求，為追求利潤的最大化，往往會選擇超規模養殖，導致生豬生存環境差，易發病。生豬發病后，養殖戶為了不虧本，盲目選擇藥物、多藥物配伍、加大劑量給與治療，使發病的生豬在不規范用藥的環境中被動攝入多類且量大的藥物，在無形之間導致細菌耐藥性的增加。研究結果顯示，豬糞源葡萄球菌對過去治療葡萄球菌的β-內酰胺類、四環素類和林可胺類均有較高的耐藥率，這可能與該類藥物被長期、大量不合理使用有關[2]。所以為了防止耐藥性的產生，臨床用藥時應注意嚴格掌握適應癥，不濫用抗菌藥物，單一抗菌藥物有效的就不要采用聯合用藥，保證用藥劑量和用藥持續時間。其次規模化養殖的雞場環境普遍較差，雞群作為高密度集中飼養的食品動物，養殖戶為確保雞群的健康，防止發病后出現大規模死亡等現象，在日常管理中不得不使用大量的抗生素，增加養殖成本，導致細菌對各種抗生素產生了耐藥性，療效下降，陷入了“耐藥-換藥(加藥)-再耐藥”的迷途困境，治療之路越走越窄[11]。羊糞源葡萄球菌和牛糞源葡萄球菌耐藥情況相對不嚴重，原因可能是動物處于半放牧的飼養方式，使用抗菌藥物時無法集中給藥，導致動物攝入的抗菌藥物含量偏少。

3.2 不同動物糞源葡萄球菌耐藥基因檢測

實驗共檢測了β-內酰胺類(mecA，femA)、四環素類(tetA)、喹諾酮類(norA)、酰胺醇類(cfr、fexA)和林可胺類(ermB)7種耐藥基因。耐藥基因檢出結果顯示，雞糞源葡萄球菌和豬糞源葡萄球菌耐藥基因攜帶率最高的是ermB。羊糞源葡萄球菌和牛糞源葡萄球菌耐藥基因檢測率最高的是femA。結合藥敏試驗結果可以看出，羊糞源葡萄球菌、牛糞源葡萄球菌和豬糞源葡萄球菌耐藥基因檢出結果與耐藥結果基本一致，羊糞源葡萄球菌對被檢測的β-內酰胺類抗菌藥物苯唑西林和頭孢噻呋的耐藥率超過50.0%；牛糞源葡萄球菌對被檢測的β-內酰胺類抗菌藥物苯唑西林耐藥率高達59.4%，對頭孢噻呋的耐藥率也達到34.1%；而豬糞源葡萄球菌對被檢測的林可胺類抗菌藥物克林霉素的耐藥率高達74.2%，以上結果表明，耐藥基因的攜帶是細菌對抗菌藥物產生耐藥的主要原因之一。值得注意的是，雞糞源葡萄球菌對四環素類耐藥率最高，但四環素類耐藥基因tetA檢出率未超過10.0%，對被檢測的林可胺類抗菌藥物(克林霉素)的耐藥率僅為18.5%，但林可胺類耐藥基因ermB的檢出率卻最高，出現這種結果的原因可能是雞糞源葡萄球菌對四環素的耐藥不是由四環素耐藥基因tetA所介導，可能存在其他未檢測的耐藥基因(如tetB)，甚至是存在新的耐藥機制。耐藥基因共存結果顯示，除羊糞源葡萄球菌，其他3種動物糞源葡萄球菌均以ermB+fexA基因共存為主，這與3種動物源葡萄球菌對林可胺類和酰胺醇類抗菌藥物耐藥程度呈正比關系。

4 結 論

霍城地區不同動物糞源葡萄球菌對被檢抗菌藥物耐藥情況嚴重，對被檢抗菌藥物的耐藥率在3.0%～93.0%，耐藥程度由高到低依次為豬糞源葡萄球菌>雞糞源葡萄球菌>羊糞源葡萄球菌>牛糞源葡萄球菌，多藥耐藥情況嚴重，且存在多種耐藥基因共存情況，以攜帶ermB和femA基因為主。新疆霍城縣不同動物糞源葡萄球菌在治療細菌性疾病時，需慎用酰胺醇類及林可胺類藥物，合理交替輪換使用抗生素有利于縮短治療周期，提高治療效果，亦能有效減少耐藥菌的產生。