普羅布考對非對稱性二甲基精氨酸誘導的人腦微血管內皮細胞凋亡的作用

王艮衛,劉 展,馬繼偉,周文科,牛光明,常克亮,婁金峰

1)鄭州大學第二附屬醫院神經外科 鄭州 450014 2)新鄉醫學院第一附屬醫院神經外科 河南衛輝 453100

缺血性腦血管病的早期病理機制是內皮細胞功能障礙[1]。非對稱性二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine,ADMA)是一種超強的內源性一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)抑制劑，可引起多種腦血管疾病的內皮功能障礙[2-3]。研究[4]表明，ADMA可增加內皮細胞氧化應激，誘導血管炎癥反應，加速腦血管疾病的進程。因此，抑制ADMA誘導的內皮細胞損傷和氧化應激可能是治療缺血性腦血管損傷的有效方法。已有研究[5]表明，普羅布考可顯著抑制促炎細胞因子，抑制自由基介導的炎癥反應，提高內皮舒張功能，從而抑制泡沫細胞和動脈粥樣硬化斑塊的形成。普羅布考可在體外亨廷頓病模型中調節氧化應激[6]，改善無癥狀腔隙性腦梗死患者的內皮功能[7]。本研究觀察了普羅布考對ADMA誘導的人腦微血管內皮細胞(human brain microvascular endothelial cell,HBMEC)損傷的保護作用，并且分析其在JNK/P38 MAPK信號傳導通路中的作用，報道如下。

1 材料與方法

1.1細胞和主要試劑HBMEC購自北京拜爾迪診斷技術有限公司；RPMI 1640、胎牛血清購自美國Gibco公司；JNK特異性抑制劑SP600125、P38 MAPK特異性抑制劑SB203580和普羅布考購自美國Calbiochem公司；ADMA、Caspase-3檢測試劑盒購自美國Sigma公司；增強的化學發光蛋白印跡檢測試劑購自美國Pierce公司；DMSO、MTT、抗P38、抗p-P38、抗JNK和抗p-JNK多克隆抗體購自英國Abcam公司；LDH、ROS測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；小鼠抗β-actin單克隆抗體購自上海艾比瑪特醫藥科技有限公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠/兔IgG購自美國Santa Cruz公司。

1.2細胞培養和處理將HBMEC培養在含有105U/L青霉素、100 g/L鏈霉素和體積分數10%胎牛血清的RPMI 1640培養基中，在37 ℃用體積分數5%CO2在潮濕的培養箱中培養。每2～3 d更換一次培養基。將生長活躍的第4～6代HBMEC用于實驗研究。細胞分組如下。①治療組：加入30 μmol/L ADMA及普羅布考，其中普羅布考分為10-8、10-7、10-6、10-5mol/L 4個劑量組。②ADMA組：僅加入30 μmol/L ADMA。③普羅布考組：僅加入10-5mol/L普羅布考。④對照組：不加藥物。治療組細胞處理方法：將細胞在無血清培養基中饑餓處理24 h后用30 μmol/L ADMA進行處理，在ADMA處理前20 min給予普羅布考。普羅布考、ADMA干預細胞時間為24 h[8-9]。以上分組用于測定細胞活性、LDH釋放量和腦源性神經營養因子(BDNF);其他指標測定時采用析因設計分為對照組、ADMA組、ADMA+普羅布考組、普羅布考組，ADMA劑量為30 μmol/L，普羅布考劑量為10-5mol/L。實驗另設對照組、ADMA組、ADMA+普羅布考組、ADMA+SP600125組、ADMA+SB203580組、普羅布考組，ADMA+SP600125組和ADMA+SB203580組分別用SP600125(10 μmol/L)和SB203580(25 μmol/L)處理1 h，其他處理條件同上。

1.3細胞活性的MTT法檢測將各組細胞置于96孔板中并在常規條件下培養至其融合率達80%。然后棄去培養基，每孔加入含有MTT(5 g/L)的新鮮培養基150 μL后培養4 h，每孔加入150 μL DMSO并輕搖10 min以溶解甲瓚。采用酶標儀測定490 nm處的吸光度(A)，細胞活性=加藥組A/對照組A×100%。實驗設置3個復孔，重復3次。

1.4LDH釋放量的比色法測定各組細胞用體積分數0.2%TritonX-100裂解，4 ℃、10 000×g離心2 min，收集上清液，在37 ℃與丙酮酸(0.5 mmol/L，25 μL)和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(2 mmol/L，60 μL)共培養15 min，加入NaOH(0.4 mol/L)完成反應。檢測530 nm處的A值，采用標準曲線法計算LDH釋放量。實驗設置3個復孔，重復3次。

1.5細胞中丙二醛(MDA)和BDNF的ELISA法測定取各組細胞，5 000×g離心后收集細胞，加入PBS制成細胞懸液后，采用ELISA法測定MDA、BDNF。實驗設置3個復孔，重復3次。

1.6細胞中ROS釋放量的DCFH-DA法測定各組細胞用PBS洗滌3次后，加入DCFH-DA 10 μmol/L在37 ℃培養6 h。然后將細胞置于微量滴定板的孔中應用熒光酶標儀檢測各孔熒光強度，檢測條件為激發波長480 nm、發射波長530 nm，ROS釋放量以平均熒光強度表示。實驗設置3個復孔，重復3次。

1.7細胞中bax、bcl-2、內皮型NOS(eNOS)mRNA表達的RT-PCR法測定各組細胞提取并純化總RNA，反轉錄。bax、bcl-2、eNOS引物序列見表1，β-actin作為內參。PCR條件： 94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃聚合30 s，35個循環。所得PCR產物在15 g/L瓊脂糖凝膠上進行分離，并在透照儀下用溴化乙錠顯色。目的mRNA相對表達量=目的條帶灰度值/內參條帶灰度值。實驗重復9次。

表1 bax、bcl-2、eNOS及內參引物序列

1.8細胞中Caspase-3蛋白活性的比色法測定收集各組細胞并用冷PBS洗滌，于裂解液中冰懸15 min。將裂解物以10 000×g離心20 min，收集上清液并計算蛋白濃度。取細胞提取物30 μg與200 μmol/L乙酰基Asp-Glu-Val-Asp-p-硝基苯胺在37 ℃培養2 h后在405 nm處測定A。Caspase-3活性=加藥組A/對照組A。實驗設置3個復孔，重復3次。

1.9細胞中p-JNK、JNK、p-P38、P38蛋白的免疫印跡法測定各組細胞在細胞裂解緩沖液中裂解，采用Bradford方法測定蛋白濃度。將20～30 μg蛋白加載到120 g/L SDS-PAGE凝膠上，并印跡到聚偏二氟乙烯膜上。將膜用25 g/L脫脂牛奶在37 ℃封閉1 h，加入一抗(JNK、p-JNK、P38、p-P38均按1∶1 000稀釋，內參β-actin按1∶2 000稀釋)4 ℃培養過夜，加入二抗(均按1∶2 000稀釋)培養1 h后，采用化學發光法檢測蛋白條帶灰度值。目的蛋白相對表達量=目的蛋白條帶灰度值/內參條帶灰度值。實驗重復9次。

1.10統計學處理采用SPSS 19.0進行數據分析。不同組間HBMEC細胞活性、LDH釋放量、BDNF、p-JNK/JNK、p-P38/P38的比較均采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；MDA，ROS釋放量，bcl-2、bax、eNOS mRNA相對表達量，Caspase-3蛋白活性的比較均采用析因設計的方差分析。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.17組細胞活性、LDH釋放量、BDNF的比較結果見表2。由表2可知，與對照組相比，ADMA組LDH釋放量升高，細胞活性和BDNF降低；與ADMA組相比，普羅布考組和各ADMA+普羅布考組LDH釋放量降低，細胞活性和BDNF升高。

表2 7組細胞活性、LDH釋放量、BDNF比較

*：與對照組相比，P<0.05；#：與ADMA組相比，P<0.05

2.24組細胞MDA,ROS釋放量,bcl-2、bax、eNOS mRNA相對表達量,Caspase-3蛋白活性的比較結果見表3。由表3可知，ADMA主效應使MDA、ROS釋放量、bax mRNA相對表達量、Caspase-3蛋白活性升高，bcl-2、eNOS mRNA相對表達量降低；普羅布考主效應使MDA、ROS釋放量、eNOS mRNA相對表達量升高，bcl-2、bax mRNA相對表達量及Caspase-3蛋白活性降低；且ADMA與普羅布考存在交互作用。

表3 4組細胞MDA,ROS釋放量,bcl-2、bax、eNOS mRNA相對表達量,Caspase-3蛋白活性的比較

2.36組細胞p-JNK/JNK、p-P38/P38的比較結果見表4。由表4可知，與對照組相比，ADMA組、ADMA+普羅布考組、ADMA+SP600125組、ADMA+SB203580組p-JNK/JNK、p-P38/P38升高；與ADMA組相比，ADMA+普羅布考組p-JNK/JNK、p-P38/P38降低。

表4 6組細胞p-JNK/JNK、p-P38/P38的比較

*：與對照組相比，P<0.05；#：與ADMA組相比，P<0.05

3 討論

有證據[10]表明，某些心血管疾病的內皮功能障礙與血漿ADMA水平升高有關。因此，保護內皮細胞免受ADMA誘導的損傷可能是缺血性腦血管疾病的有效治療方法。最近的研究[11-12]表明，普羅布考可以在體內預防次氯酸鹽誘導的內皮功能障礙，并在AD小鼠模型中預防血腦屏障功能障礙。

LDH是活細胞漿內酶，細胞膜通透性變化時，細胞會將LDH釋放到培養液中，LDH釋放增加。BDNF能抑制氧化應激誘導的細胞凋亡，BDNF降低提示細胞抑制氧化應激誘導的細胞凋亡的能力下降，細胞更容易受損。在本研究中，用30 μmol/L ADMA處理HBMEC后，細胞LDH釋放增加，細胞活性和BDNF降低，這與之前的研究[5]結果相符。

近年來ROS被認為是細胞內信號分子，且在細胞凋亡中起重要作用。已有報道[13]指出，ADMA通過內皮細胞中“NOS活性的解偶聯”增加細胞內ROS的產生。該研究結果顯示， ADMA可顯著增加細胞內ROS生成，并且下調HBMEC中eNOS的表達。作者還發現普羅布考預處理顯著降低了ROS的產生，增強了eNOS mRNA的表達。MDA是脂質過氧化的一個重要指標。結果顯示ADMA顯著提高了體外培養的HBMEC中MDA的水平；而普羅布考顯著降低了由ADMA誘導的MDA形成。提示普羅布考通過抗氧化或調節內源性抗氧化系統保護內皮細胞免受ADMA誘導的細胞毒性。

Bax/Bcl-2家族由許多重要的凋亡調節因子組成，Bax/Bcl-2表達的改變可影響細胞凋亡過程。Caspase-3主要處于細胞凋亡反應的下游，是蛋白水解級聯反應的核心組成部分，在細胞凋亡過程中起著關鍵作用[14]。該研究結果顯示，經ADMA處理后HBMEC中Caspase-3蛋白活性和bax mRNA表達上調，bcl-2 mRNA表達下調。普羅布考預處理可抑制bax mRNA的表達和Caspase-3蛋白活性，提高bcl-2 mRNA的表達，從而證實了普羅布考對ADMA誘導的細胞凋亡的保護作用。

據報道[14]，P38 MAPK的激活可誘導多種細胞凋亡。先前的研究[10]顯示，ADMA通過P38 MAPK/Caspase-3依賴信號通路誘導內皮細胞凋亡。此外，據報道[15]JNK磷酸化在細胞凋亡中起重要作用。作者應用JNK特異性抑制劑SP600125和P38 MAPK特異性抑制劑SB203580處理細胞，結果顯示，ADMA可誘導JNK和P38 MAPK的磷酸化，而普羅布考預處理可抑制JNK和P38 MAPK信號的激活，正如用JNK和P38 MAPK特異性抑制劑處理的一樣。以上結果說明，普羅布考可以調節ADMA處理的HBMEC中JNK/P38 MAPK信號通路，這可能是普羅布考誘導的保護作用的潛在機制。之前的研究[5]顯示，與對照組相比，普羅布考對內皮細胞不產生明顯的影響。本研究中析因分析結果顯示普羅布考主效應對HBMEC各指標均產生影響，與上述研究[5]結果不符，需進一步研究證實。

總之，該研究結果證實了普羅布考對ADMA誘導的HBMEC損傷有保護作用，其作用機制為促進細胞活性、增加BDNF釋放、清除ROS、減少脂質氧化和抑制細胞凋亡。此外，普羅布考可能是通過調節JNK/P38 MAPK信號通路發揮其保護作用。