一個B1型短指/趾畸形家系的臨床特征及基因突變分析

王青青，卞莎莎，王圣然，婁桂予，王 鑫，秦利濤，郝冰濤，廖世秀

1)河南省人民醫(yī)院(鄭州大學人民醫(yī)院)醫(yī)學遺傳研究所；河南省遺傳性疾病功能基因重點實驗室 鄭州 450003 2)鄭州大學醫(yī)學科學院 鄭州 450052

先天性短指/趾(brachydactyly，BD)畸形是指(趾)骨和(或)掌(跖)骨發(fā)育不良導致指(趾)短小、缺失或融合，是一種家族遺傳性疾病。短指(趾)畸形也可伴有其他手/足部畸形，如并指(趾)畸形、多指(趾)畸形、縮小畸形[1]。與所有先天性畸形一樣，短指畸形可以單獨出現(xiàn)或作為復雜畸形綜合征的一部分出現(xiàn)[2]。短指畸形可分為5種類型(A～E型)，相同類型的短指表型差異可能很大[3]。B型短指畸形 (brachydactyly type B，BDB)是短指畸形中最嚴重的一種，可分為B1(MIM 113000)和B2(MIM 611377)2個亞型。B1型短指畸形(brachydactyly type B1，BDB1)主要臨床特征包括食指到小指末梢發(fā)育不全，伴有指甲部分或完全缺失，拇指受累少，偶可見拇指/趾寬大畸形，腳也受到類似影響，但程度較輕，嚴重程度因人而異[4]。本研究報道了在河南地區(qū)發(fā)現(xiàn)的一個短指/趾畸形家系，先證者及其家系臨床特征分析符合BDB1型。通過二代測序發(fā)現(xiàn)先證者受體酪氨酸激酶樣孤兒受體2(receptor tyrosine kinase like orphan receptor 2，ROR2)基因存在一新發(fā)的移碼突變：c.2290delG(p.A764fs*10)。現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 對象與方法

1.1研究對象先證者，女性，31歲，漢族，以“短指/趾畸形”為主訴就診于鄭州大學人民醫(yī)院遺傳咨詢門診。該家系來自河南省，共24人，9人出現(xiàn)短指癥狀，符合常染色體顯性遺傳規(guī)律(圖1)。簽署知情同意書后，采集家系內(nèi)5例患者和3例正常親屬外周血。3位患者行雙手/足X線檢查。本研究經(jīng)鄭州大學人民醫(yī)院倫理委員會批準。

圖1 短指/趾畸形家系圖

1.2短指/趾畸形患者全基因組二代測序及基因突變分析使用EDTA抗凝管收集5例患者和3例正常親屬外周血3 mL，應用基因組提取試劑盒(QLAamp血液DNA純化mini試劑盒)提取基因組DNA，使用Qubit dsDNA HS試劑盒對樣品DNA進行定量及質(zhì)量控制。按照Agilent公司SureSelectXT Target Enrichment System試驗流程，采用捕獲方法對2 742個基因(試劑編號：5190-7519)進行擴增，用Illumina Nextseq500二代測序儀對擴增產(chǎn)物進行測序分析。排除突變位點多態(tài)性后，發(fā)現(xiàn)先證者ROR2(NM_004560.3)基因上一個移碼突變。針對該突變，使用Primer 5.0設計引物。ROR2上游引物序列5’-GCATTGGGATCTGCACCGGG-3’，下游引物序列5’-AAGGACCTGGCCACCCGCAA-3’；引物由上海生物工程技術(shù)服務有限公司合成。PCR擴增體系25 μL。PCR反應條件：95 ℃ 5 min變性；95 ℃ 30 s，64 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35 個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物交由擎科生物有限公司進行Sanger雙向測序驗證。

2 結(jié)果

2.1該家系的臨床特征該家系患者的手足外觀檢查見雙手大拇指寬大扁平，第2～5指短小、末節(jié)指骨明顯縮短或缺失，中、末節(jié)指骨關節(jié)處皮膚紋理消失、畸形指甲小而且發(fā)黑；所有患者足部均有受累，基本符合BDB1型表現(xiàn)(圖2～4)。該家系患者的X線片顯示雙手大拇指末節(jié)指骨發(fā)育畸形，第2～5末端指骨缺失，部分中節(jié)指骨發(fā)育不良及中、末節(jié)指骨融合；雙足X線片顯示雙足第2～5趾均有中節(jié)趾骨缺失，部分末節(jié)趾骨發(fā)育畸形(圖2～4)。該家系患者的臨床表現(xiàn)具有異質(zhì)性，先證者Ⅳ2右手第3、5掌骨明顯縮短，右足第4跖骨縮短，左足第3、5跖骨縮短(圖2)。先證者父親Ⅲ2雙手外觀檢查見雙手第2、3末節(jié)指骨缺失，第4、5中、末節(jié)指骨缺失。先證者堂弟、堂妹與先證者的父親Ⅲ2表型相似(圖3～4)。先證者叔叔Ⅲ8未參加本項研究。

2.2基因突變分析先證者Ⅳ2基因檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)ROR2基因第9外顯子上存在一個c.2290delG(p.A764fs*10)雜合突變(圖5)。通過對先證者的父親(Ⅲ2)、女兒(Ⅴ1)、堂弟(Ⅳ8)、堂妹(Ⅳ7)4位進行Sanger測序，發(fā)現(xiàn)均存在c.2290delG雜合突變。表型正常的Ⅲ3、Ⅲ4(圖5)和Ⅳ5均無此突變。該致病突變在本家系中符合常染色體顯性遺傳規(guī)律(圖1)。

圖2 先證者手足外觀和X線片

圖3 先證者堂妹Ⅳ7手足照片及X線片

圖4 先證者堂弟Ⅳ8及父親Ⅲ2雙手照片

圖5 Ⅲ2、Ⅳ2、Ⅳ7、Ⅳ8、Ⅴ1患者以及Ⅲ4表型正常人的Sanger測序圖

2.3基因突變功能預測該家系中ROR2基因c.2290delG雜合突變?yōu)橐拼a突變，導致第764位密碼子編碼的氨基酸由丙氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楦彼幔乙拼a突變造成ROR2氨基酸序列提前終止，由正常編碼的943個氨基酸變?yōu)?73個氨基酸，致使該蛋白質(zhì)部分功能區(qū)域缺失。

3 討論

先天性手畸形是一種臨床上高度異質(zhì)性的疾病，臨床表型差異非常大，包括并指、短指和缺指[5]。此外，一個特定的表型還包含幾個亞型，如BDB1，這是一種常見的先天性手部畸形亞型，以指骨和指甲的遠端發(fā)育不全為特征，部分患者伴有明顯的面部體征，如人中短和鼻骨突出[6]。該家系所有患者以雙手第2～5末端指骨短小或缺失，中、末節(jié)指骨融合，中節(jié)指骨發(fā)育不全為主要表現(xiàn)，基本符合BDB1的特點；同時該家系所有患者均有大拇指末節(jié)指骨畸形、中節(jié)趾骨缺失，部分患者存在掌骨(跖骨)縮短。BDB1也具有高度遺傳異質(zhì)性，但ROR2基因突變引起患者大拇指末節(jié)指骨畸形、中節(jié)趾骨缺失，部分患者存在掌骨(跖骨)縮短等表型少見報道。

ROR2基因定位于9q22，全長235 kb，共9個外顯子，編碼長度為943個氨基酸的ROR2蛋白[7]。ROR2基因編碼的跨膜蛋白由胞外區(qū)、跨膜區(qū)、胞內(nèi)區(qū)3個部分組成：與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用相關的細胞外區(qū)域，包括免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域(Ig)、卷曲的半胱氨酸富集區(qū)(CRD)和kringle結(jié)構(gòu)域(Kr)；胞內(nèi)區(qū)域包括酪氨酸激酶域(TK)、2個絲/蘇氨酸富集區(qū)(ST)和脯氨酸富集區(qū)(PRD)[8]。目前發(fā)現(xiàn)的BDB1致病基因多位于ROR2的8、9號外顯子上，至今在中國人群中發(fā)現(xiàn)至少6種突變，多為無義突變或移碼突變，導致ROR2蛋白胞內(nèi)區(qū)TK附近的結(jié)構(gòu)域缺失[9]。ROR2蛋白是Wnt5a的受體，其細胞外卷曲的CRD與Wnt5a結(jié)合，胞質(zhì)區(qū)的PRD和S/TRD2與細絲蛋白A相結(jié)合，激活JNK而影響軟骨細胞的增殖與極性遷移，該蛋白可能參與軟骨細胞的早期形成，是軟骨和生長板發(fā)育所必需的[9-10]。針對該家系的突變研究發(fā)現(xiàn)該突變產(chǎn)生一個只有774個氨基酸的截短ROR2蛋白，該截短蛋白缺少了ROR2蛋白的ST和PRD，可能導致Wnt5a/ROR2信號通路傳導異常而引起B(yǎng)DB1。

本研究中，作者對一個符合常染色體顯性遺傳模式的BDB1型短指畸形家系進行了突變基因檢測，發(fā)現(xiàn)該家系成員患病的遺傳學基礎是ROR2基因c.2290delG(p.A764fs*10)雜合突變。該突變與家系疾病表型共分離，查詢dbSNP、人類基因突變數(shù)據(jù)庫(HGMD)、ExAC外顯子組整合數(shù)據(jù)庫，均未見該變異報道，預測為新發(fā)現(xiàn)的致病突變，但需要進一步做功能驗證。該突變豐富了ROR2突變譜，為進一步理解該疾病發(fā)病原因提供了遺傳學基礎，同時為該家系成員的遺傳學咨詢及產(chǎn)前診斷提供了分子依據(jù)。