紫檀芪對2型糖尿病大鼠肝損傷的作用

張玉晶，孫華磊，劉欣欣，王 騰，李 星，李文杰

鄭州大學公共衛生學院營養與食品衛生學教研室 鄭州 450001

據報道[1]，全球超過4.25億人患有糖尿病，預計到2045年，糖尿病患者的數量可能會升至6.93億；2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)患者約占糖尿病患者的90%。有研究[2]表明，炎癥是T2DM的發病機制之一，可導致胰島素抵抗。肝臟是胰島素的主要靶器官之一，胰島素通過肝細胞上的受體進入肝細胞，合成肝糖原，維持血糖穩定。當糖尿病發生時，血糖升高，代謝紊亂。紫檀芪(pterostilbene，PTE)是一種天然的多酚類化合物，廣泛存在于藍莓、黑莓和其他漿果中。已有研究[3-6]報道PTE具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、鎮痛、抗糖尿病、抗肥胖及神經保護作用。Kosuru等[7]發現PTE可以減輕糖尿病大鼠心肌氧化應激和炎癥反應。本研究觀察了T2DM大鼠肝損傷情況，并評價了PTE對大鼠肝損傷的保護作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1材料雄性4周齡SPF級SD大鼠50只(170～220 g，動物許可證號SCXK 2015-0004)，購自河南省實驗動物中心。鏈脲佐菌素(STZ)購自美國Sigma公司，PTE購自上海士豐生物科技有限公司。ALT和AST比色法測試盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司。IL-6和IL-1β ELISA檢測試劑盒購自北京博奧森生物技術有限公司，TNF-α ELISA檢測試劑盒購自欣博盛生物科技有限公司。組織蛋白抽提試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司。IL-6多克隆抗體和NF-κBp50多克隆抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司。BCA蛋白濃度測定試劑盒、β-actin多克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠和山羊抗兔IgG均購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。

1.2T2DM大鼠模型的建立及實驗分組50只大鼠分為正常對照組，模型組及低、中、高劑量PTE組，每組10只。除正常對照組外，其他4組采用高脂高糖飲食和STZ結合的方法誘導T2DM模型[8]，注射STZ 72 h后，大鼠空腹血糖為≥11.1 mmol/L并出現多飲、多食、多尿等癥狀，且1周后血糖水平未恢復正常即為造模成功。將PTE溶于羧甲基纖維素鈉溶液中；正常對照組和模型組大鼠僅給予羧甲基纖維素鈉溶液灌胃處理，而低、中、高劑量PTE組則分別給予20、40、80 mg/kg的PTE溶液灌胃處理。連續干預12周后麻醉，腹主動脈取血備用；隨后處死大鼠，收集肝臟標本。

1.3肝組織形態學觀察用40 g/L多聚甲醛溶液快速固定肝組織，石蠟包埋。4 μm厚切片，常規脫蠟脫水，HE染色，光學顯微鏡下觀察。

1.4血清ALT、AST水平檢測血樣置于冰上30 min，5 000 r/min、4 ℃離心10 min，取上清。按照試劑盒說明書步驟測定血清ALT、AST水平。

1.5血清IL-6、IL-1β和TNF-α水平檢測取血樣，分離血清，按照ELISA檢測試劑盒說明書步驟檢測血清IL-6、IL-1β和TNF-α水平。

1.6肝組織NF-κB、IL-6蛋白表達水平的檢測取肝組織稱重，用組織蛋白抽提試劑盒提取蛋白。以BSA為標準品，BCA法測定總蛋白，然后用5×SDS蛋白電泳上樣緩沖液進行變性處理。每個泳道蛋白上樣量為80 μg，行SDS-PAGE，轉膜，50 g/L脫脂奶粉溶液封閉1.5 h。加一抗(β-actin多克隆抗體按1∶5 000稀釋，NF-κBp50、IL-6多克隆抗體均按1∶1 000稀釋)，4 ℃孵育過夜。TBST漂洗3次，10 min/次。加入按1∶5 000稀釋的二抗，室溫孵育2 h。TBST漂洗3次，10 min/次。ECL化學發光，成像結果用Image J軟件處理。以目的蛋白與內參β-actin條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達量。

1.7統計學處理采用SPSS 23.0處理數據。5組大鼠以上各項檢測指標的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1各組大鼠肝組織形態及肝功能比較正常對照組肝組織結構清晰，胞質染色較深，肝細胞排列規則，未見明顯的病理變化(圖1A)。模型組肝小葉肝索結構紊亂，肝細胞腫脹、體積增大，細胞質疏松，局部炎性細胞浸潤、出血(圖1B)。與模型組相比，PTE各劑量組大鼠肝組織形態有不同程度的改善(圖1C、D、E)。與正常對照組相比，模型組血清ALT、AST水平升高(P<0.05)。與模型組相比，低、中、高劑量PTE組ALT、AST水平均降低(P<0.05)；其中，高劑量PTE組的干預效果最為顯著。見表1。

A：正常對照組；B：模型組；C：低劑量PTE組；D：中劑量PTE組；E：高劑量PTE組

表1 各組大鼠血清ALT、AST水平比較(n=10) IU/L

*：與正常對照組相比，P<0.05；#：與模型組相比，P<0.05

2.2各組大鼠血清IL-6、IL-1β和TNF-α水平的比較與正常對照組相比，模型組血清IL-6、IL-1β和TNF-α水平均升高(P<0.05)。與模型組相比，低、中、高劑量PTE組IL-6水平降低(P<0.05)，高劑量PTE組IL-1β水平降低(P<0.05)，低、高劑量PTE組血清TNF-α水平下降(P<0.05)；且高劑量PTE組血清IL-6、IL-1β水平與正常對照組相比，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清炎性細胞因子水平比較(n=10) ng/L

*：與正常對照組相比，P<0.05；#：與模型組相比，P<0.05

2.3各組大鼠肝組織中NF-κB和IL-6蛋白表達水平的比較與正常對照組相比，模型組NF-κB和IL-6蛋白表達水平升高(P<0.05)。與模型組相比，低、中、高劑量PTE組NF-κB和IL-6蛋白表達水平降低(P<0.05)；其中高劑量PTE組NF-κB蛋白表達的干預效果最顯著，而低劑量PTE組IL-6蛋白表達的干預效果最顯著。見圖2、表3。

A：正常對照組；B：模型組；C：低劑量PTE組；D：中劑量PTE組；E：高劑量PTE組

圖2 各組大鼠肝組織中NF-κB和IL-6蛋白的表達

表3 各組大鼠肝組織中NF-κB和IL-6蛋白的表達(n=10)

*：與正常對照組相比，P<0.05；#：與模型組相比，P<0.05

3 討論

肝臟是機體糖脂代謝的主要部位。有研究[9-10]表明，糖尿病會造成大鼠肝損傷，引起肝功能下降。本研究采用高脂高糖飲食和STZ誘導建立T2DM模型，觀察PTE對T2DM大鼠肝損傷的干預效果。結果表明，模型組大鼠肝臟有明顯水腫、炎性細胞浸潤，同時血清ALT和AST水平升高，提示T2DM大鼠肝功能受損；而PTE干預可減輕T2DM大鼠肝組織病理變化，同時降低血清ALT和AST水平，且高劑量PTE干預效果更為明顯。

胰島素抵抗在糖尿病的發病中發揮重要作用，而炎癥通過多種細胞因子和分子途徑在胰島素抵抗的發展中發揮重要作用[2]。據報道[11-12]，炎性細胞因子如TNF-α、IL-1β和IL-6水平的升高與糖尿病嚴重程度有關。Chen等[13]發現減輕炎癥可改善胰島素抵抗。本研究結果顯示，模型組大鼠血清IL-6、IL-1β和TNF-α水平升高，PTE尤其是高劑量PTE干預后上述指標均有不同程度的降低，且高劑量PTE組血清IL-6、IL-1β水平與正常對照組相比，差異無統計學意義，表明PTE可能通過抑制炎癥反應來保護肝臟免受損傷。NF-κB是一種轉錄因子，調節一系列重要生物過程的基因表達，如細胞凋亡、細胞增殖、DNA修復、免疫和炎癥反應等[14-17]。以往的研究[18-19]表明NF-κB在糖尿病的發病機制中起著重要作用。NF-κB通路的激活會導致胰島素受體底物(IRS-1或IRS-2)絲氨酸激酶磷酸化，阻礙胰島素信號傳遞，最終可能導致胰島素抵抗。此外，NF-κB通路參與了炎性細胞因子的產生，它們反過來又可以作為刺激物激活該通路[2]。Qureshi等[20]發現PTE具有蛋白酶體抑制劑的類似功效，它可以抑制NF-κB抑制物的激活，從而抑制炎性細胞因子基因的激活，進而減少TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌。

在本研究中，T2DM大鼠肝組織中NF-κB和IL-6蛋白的表達水平均升高，而PTE干預可降低肝組織中NF-κB和IL-6蛋白的表達水平，其中高劑量PTE組干預NF-κB蛋白表達的效果最顯著，而低劑量PTE組干預IL-6蛋白表達的效果最顯著，考慮應與炎性細胞因子種類多樣有關。雖然低劑量PTE處理后IL-6蛋白的表達水平有所降低，但炎性細胞因子眾多，結合起來仍會刺激NF-κB的產生，故而PTE干預劑量越高，對NF-κB的抑制效果越好。我們的研究結果表明，PTE干預產生的保護作用可能與抑制NF-κB有關，具體機制將進行細胞實驗進一步探索。

綜上所述，PTE可減輕糖尿病大鼠肝損傷、減輕炎癥反應，其具體機制可能與抑制NF-κB/IL-6通路及炎癥反應有關。PTE或可用于糖尿病的輔助治療。