B(A)02亞型一例分子遺傳學特征

孔永奎，孔存權，宋 婕，邵 明，王 莉，劉 欣，楊乾坤，呂先萍

1)鄭州大學第一附屬醫院輸血科 鄭州 450052 2)河南省人民醫院輸血科 鄭州 450003

因受到抗原、抗體減弱等的干擾，ABO血型血清學試驗常常會遇到鑒定困難、表型異常等現象，這些異常現象可由遺傳性或繼發性因素所致。遺傳性ABO表型變異稱為ABO亞型，其遺傳屬性決定了血型鑒定和交叉配血的困難性，在很大程度上影響了救治。若ABO亞型鑒定錯誤，將大大增加輸血風險。目前“精準醫學”和“精準輸血”理念方興未艾，分子生物學和分子遺傳學在輸血醫學的應用進一步推動了“精準輸血”的發展。ABO基因克隆和測序的完成使得進一步闡明ABO亞型的分子遺傳學機制成為可能。現已發現ABO變異型等位基因300多個，其中B(A)亞型等位基因有6個[1]。因比較罕見且缺少群體遺傳學的統計，目前B(A)各型等位基因在人群中的分布不甚明了。國內有些研究[2-5]認為B(A)亞型中較常見的等位基因是BA.04和BA.02，這兩型通常被認為是遺傳學B型，血清學檢測結果多表現為AB型，但具體到個體，血清學可能會表現出較大的差異。本文擬通過一例B(A)02亞型的鑒定，來探討B(A)血型的分子遺傳學特征。

1 對象與方法

1.1研究對象患者(即先證者)女，28歲，孕12周，因在當地醫院孕檢無法確定血型至鄭州大學第一附屬醫院輸血科進行血型鑒定。隨后采集其父母血樣進行血型檢測。

1.2血清學鑒定主要試劑包括單克隆抗A、抗B(長春博迅公司)，抗A1、抗H(Sanquin公司)，抗D IgM(珠海BASO)，抗A,B(上海血液生物醫藥公司)；人源抗A、抗B 為本實驗室自制，效價128；Ac、Bc、Oc細胞購自長春博德公司。血型血清學鑒定和操作步驟參照《全國臨床檢驗操作規程》。

1.3ABO基因的擴增和測序采用北京TIANGEN公司的血液基因組試劑盒抽提血樣DNA。參照文獻[6]建立的方法擴增ABO基因的1～7外顯子，擴增結束后取5 μL產物上樣到含有GelRed的20 g/L瓊脂糖凝膠中，150 V電泳30 min，紫外透射儀下觀察擴增是否成功。經酶切純化后的PCR產物直接作為測序模板，嚴格按照BigDye試劑盒(ABI公司)說明書操作，用ABI 3730測序儀進行測序。

1.4單倍型分析將PCR產物割膠純化，用DNA連接酶將第7外顯子PCR產物連接到TA克隆質粒pMD18-T中，轉化感受態細胞DH5α，搖菌擴增，抽提質粒DNA，測序后進行單倍型分析。

1.5序列的分析和比對采用DNAMAN和Chromas Pro軟件進行序列的拼接和比對。ABO等位基因的命名方法參照ISBT血型抗原等位基因數據庫。

2 結果

2.1血清學試驗先證者及其父母ABO正反定型結果見表1，可以看出先證者與其父存在正反不符，結合血清學試驗，認為其表型符合AwB或B(A)亞型。

2.2ABO基因測序對先證者ABO基因1～7外顯子及其側翼序列進行測序，結果顯示存在c.297A>G、c.526C>G、c.657C>T、c.700C>G(圖1)、c.703G>A、c.796C>A、c.803G>C、c.930G>A雜合突變及c.261delG。參照dbRBC等位基因數據庫，通過與A1.01和B.01參考序列比對(表2)，結合單倍型分析確定其基因型為ABO*BA.02/O.01.01，其中的單倍型基因BA.02與B.01相比，多了一個c.700C>G突變，說明BA.02的遺傳背景來自于B.01基因。

表1 ABO正反定型鑒定結果

w+：微弱凝集；0：表示不凝集

圖1 BA.02第7外顯子c.700C>G雜合突變

位點297526657700703796803930ABO*A1.01ACCCGCGGABO*B.01GGTCAACAABO*BA.02GGTGAACA

2.3家系分析先證者為家中獨女，祖父母已逝，未采集到先證者兄弟姐妹的血樣。測序結果顯示，其父基因型為ABO*BA.02/O.01.02，其母為ABO*A1.02/O.01.01，先證者血型基因BA.02遺傳自其父(圖2)。

圖2 家系圖

3 討論

輸血前準確鑒定患者血型很重要。ABO亞型常會導致血清學正反定型不一致，給患者輸血帶來很大的風險。分子生物學和遺傳學方法為解決疑難血型鑒定提供了強有力的工具。在遇到因血型亞型、異體輸血、父權確認、嵌合體、自身免疫性溶血性貧血等引起的血清學鑒定困難時，可以通過基因測序和家系調查的方法來分析判斷[6-7]，結合基因型和表型結果來解釋疑難血清學現象。

常見ABO亞型主要有A3/B3、Ax/Bx、Am/Bm、Ael/Bel等，此外還有一大類Aw/Bw亞型，目前沒有進行更詳細的分類。有研究者[8]提出對于現存4種表型歸類困難、出現弱凝集的反應都可以鑒定為Aw亞型，但具體的基因型必須結合分子生物學試驗才能最終確定。隨著單克隆抗A的應用，B(A)亞型檢出率逐漸增高，主要是因為有些廠家的標準血清含有鼠源單克隆MHO4，其作為一種高效價的單克隆抗A試劑能夠凝集弱A抗原[2,9]。典型的B(A)亞型主要特點是“B強A弱”，紅細胞表面含有幾乎正常的B抗原和較弱的A抗原，血清中常含有幾乎正常的抗A；倘若是BA基因和A基因共同遺傳，B(A)表型則可能由于A抗原的掩蓋被判為正常AB型，因此其血清學存在很大的異質性，僅憑血清學試驗無法準確判定其基因型。

本例B(A)亞型先證者為一名孕婦，血清學提示其為AwB或B(A)亞型，測序進一步明確了其基因型為ABO*BA.02/O.01.01，家系分析證明其BA.02基因來自于父親遺傳而非自然突變。劉長利等[4]研究認為，B(A) 血型在我國獻血人群中的檢出率可能是1/(5～10)萬，遠高于歐洲人種的1/(17～58)萬，推測BA.04和BA.02等位基因可能是我國北方漢族人群B(A)血型中的主要遺傳類型。金沙等[5]通過篩查大批量上海獻血者的cisAB和B(A)血型，發現B(A)血型BA.04和BA.02等位基因頻率較高，分別為1.6/10萬和0.78/10萬，與劉長利等的推測基本一致，提示南方江浙一帶漢族人群B(A)血型的等位基因分布與北方相似。目前國際上已報道的BA等位基因有6個，遺傳背景都來自于B基因。近年來雖然國內對B(A)的關注逐漸增多[10-13]，但其抗原形成的確切機制還未完全闡明。普遍認為BA基因產物是一種典型的雙功能酶，既能夠加成大量的UDP-Gal(尿苷二磷酸-半乳糖，B抗原糖供體)，又能夠加成少量的UDP-GalNAc(尿苷二磷酸-N-乙酰半乳糖胺，A抗原糖供體)到H抗原上，從而使得B(A)紅細胞表面既含有B抗原又含有少量A抗原。具體到本例，其較B.01多了一個c.700C>G突變，從而導致第234位氨基酸由Pro突變為Ala。該突變在序列和空間上靠近4個關鍵氨基酸(第176、235、266、268位的氨基酸)，此4個氨基酸是GTA和GTB的區別所在。邱麗等[14]通過同源建模認為p.Pro234Ala置換影響了第234位氨基酸與Met266分子間的作用力，改變了GTB識別供糖體結合凹槽的結構，使GTB具有部分GTA活性，從而使B(A)血型糖基轉移酶具有了雙功能酶的活性，能夠結合并轉移少量UDP-GalNAc至底物H抗原上，導致紅細胞膜上形成弱A抗原，從而改變了ABO血型的抗原性。

因為ABO亞型分子機制存在異質性，即相同的表型可以出現不一樣的基因型，同一表型可能存在不同的分子遺傳機制[15]，因此臨床實踐中，我們不能僅從血清學表型來直接判斷基因型，反之亦然。鑒于本例B(A)02患者體內沒有抗B抗體，且又在孕期，如果條件允許，可以采集自體血備用；若身體條件不允許，建議患者生產時備輸血可以選用洗滌B型或O型紅細胞，血漿、冷沉淀和血小板可以選用AB型。