槲皮素對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖的影響

傅 浩，尚靜雯，李 敏

1)周口市中心醫(yī)院男性病科 河南周口 466000 2)周口市中心醫(yī)院皮膚科 河南周口 466000 3)河南省人民醫(yī)院皮膚科 鄭州 450003

瘢痕疙瘩是皮膚損傷或傷口愈合過程中過度生長的瘢痕組織,其組織學(xué)特點(diǎn)為瘢痕過度形成、成纖維細(xì)胞過度增殖和細(xì)胞外基質(zhì)成分過度沉積[1]。目前，有多種方法可治療瘢痕疙瘩，包括手術(shù)、皮質(zhì)類固醇和放療等[2]。槲皮素是一種存在于多種植物中的多羥基黃酮類化合物，具有抗炎、抗病毒、降血壓、抗腫瘤等多種藥理活性[3]。研究[4]表明，槲皮素可抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究旨在探討槲皮素對體外人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖的影響，并探討相關(guān)的分子機(jī)制，以期為用槲皮素預(yù)防和治療瘢痕疙瘩提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要試劑槲皮素(美國Sigma公司)；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素(美國HyClone公司)；CCK-8檢測試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)；細(xì)胞周期檢測試劑盒(美國BD公司)；BCA蛋白濃度檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；β-actin、CDK4、Cyclin D1、STAT3和p-STAT3抗體(美國Santa Cruz公司)；辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；細(xì)胞裂解液、ECL化學(xué)發(fā)光試劑(美國Thermo Fisher Scientific公司)。

1.2瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)、分組和處理將瘢痕疙瘩組織標(biāo)本(來源于周口市中心醫(yī)院皮膚科)以PBS洗滌2次，去除表皮、血管和脂肪，將組織剪成約0.5 mm3的小塊，置于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，加入青、鏈霉素，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用組織貼壁細(xì)胞培養(yǎng)法培養(yǎng)成纖維細(xì)胞。當(dāng)原代細(xì)胞生長鋪滿皿底部時(shí)，添加PBS，輕輕晃動(dòng)致組織塊脫落，采用2.5 g/L胰蛋白酶消化傳代。取傳至第3代處于對數(shù)生長期的成纖維細(xì)胞接種到96孔板中，接種密度為1×105個(gè)/mL，將細(xì)胞分為0、10、40 μmol/L槲皮素組，每組3個(gè)復(fù)孔。槲皮素溶解于DMSO中，使用DMEM培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。

1.3瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖情況的測定取對數(shù)生長期成纖維細(xì)胞接種到96孔板中，按1.2的方法分組和處理細(xì)胞，分別于0、12、24、36、48 h時(shí)向各孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)1 h，使用酶標(biāo)儀檢測490 nm波長處的光密度(OD)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞細(xì)胞周期的測定對數(shù)生長期的成纖維細(xì)胞以1×103個(gè)/mL接種到6孔板中，于37 ℃培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁生長后按1.2的方法分組和處理，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液，使用細(xì)胞周期檢測試劑盒及流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中CDK4、Cyclin D1、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)的Western blot檢測0、10和40 μmol/L槲皮素組成纖維細(xì)胞培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液提取總蛋白，取等量蛋白加入到上樣孔中，行SDS-PAGE電泳，蛋白分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，在50 g/L脫脂奶粉液中封閉2 h， TBST洗膜3次，加入CDK4、Cyclin D1、STAT3、p-STAT3及內(nèi)參β-actin一抗(1∶1 000稀釋)，4 ℃過夜孵育， TBST洗膜3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶2 000稀釋)，室溫孵育2 h， TBST洗膜3次后加入ECL化學(xué)發(fā)光液，使用凝膠成像系統(tǒng)成像并拍照，采用Quantity One軟件分析條帶灰度值，目的蛋白相對表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用3×5析因設(shè)計(jì)的方差分析比較槲皮素濃度、作用時(shí)間及交互作用對OD值的影響；不同組間細(xì)胞周期，CDK4、Cyclin D1、STAT3和p-STAT3蛋白相對表達(dá)量的比較均采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.13組瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖活性的比較見表1。由表1可知，槲皮素能夠濃度和時(shí)間依賴性地抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖。

表1 3組瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞OD值的比較(n=3)

F槲皮素=32.019，F(xiàn)時(shí)間=52.768,F交互=18.771，P均<0.001

2.23組瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞細(xì)胞周期的比較見表2。與0 μmol/L槲皮素組比較，10、40 μmol/L槲皮素組G0/G1期細(xì)胞增多，S期和G2/M期細(xì)胞減少；與10 μmol/L槲皮素組比較，40 μmol/L槲皮素組G0/G1期細(xì)胞增多，S期和G2/M期細(xì)胞減少。

表2 3組瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞細(xì)胞周期的比較(n=3) %

*：與0 μmol/L槲皮素組比較，P<0.05；#：與10 μmol/L槲皮素組比較，P<0.05

2.33組瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中CDK4、Cyclin D1、STAT3和p-STAT3蛋白表達(dá)的比較見圖1、2和表3。與0 μmol/L槲皮素組比較，10、40 μmol/L槲皮素組細(xì)胞中CDK4、Cyclin D1、STAT3和p-STAT3蛋白相對表達(dá)量降低；與10 μmol/L槲皮素組比較，40 μmol/L槲皮素組細(xì)胞中CDK4、Cyclin D1、STAT3和p-STAT3蛋白相對表達(dá)量降低。

1～3：分別為0、10、40 μmol/L槲皮素組

1～3：分別為0、10、40 μmol/L槲皮素組

c(槲皮素)/(μmol/L)CDK4Cyclin D1STAT3p-STAT300.32±0.030.58±0.060.66±0.070.42±0.04100.20±0.02*0.40±0.04*0.50±0.05*0.23±0.02*400.08±0.01*#0.14±0.01*#0.34±0.04*#0.09±0.01*#F92.57183.09425.600117.571P<0.001<0.001<0.001<0.001

*：與0 μmol/L槲皮素組比較，P<0.05；#：與10 μmol/L槲皮素組比較，P<0.05

3 討論

瘢痕疙瘩是由于皮膚傷口愈合后瘢痕組織過度生長而形成的。成纖維細(xì)胞異常增殖在瘢痕疙瘩的形成中起重要作用[5]。當(dāng)人體皮膚受損時(shí)，在趨化因子作用下成纖維細(xì)胞被激活并增殖，沿受損部位已建立的纖維網(wǎng)絡(luò)遷移，成纖維細(xì)胞的增殖引發(fā)膠原蛋白和其他細(xì)胞外基質(zhì)的合成，并誘導(dǎo)傷口收縮[6]。因此，開發(fā)新的治療方法或?qū)ふ矣行У奶烊凰幬镆种岂：鄹泶癯衫w維細(xì)胞增殖能力，對瘢痕疙瘩預(yù)防和治療具有重要意義。槲皮素多以甙的形式存在于許多植物的花、葉、果實(shí)中，如蘆丁、槲皮甙、金絲桃甙等。先前的研究[7]主要探討了槲皮素對腫瘤的抑制作用，在瘢痕疙瘩中的研究相對較少。

本研究結(jié)果顯示，槲皮素能夠濃度和時(shí)間依賴性地抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖，阻滯細(xì)胞于G0/G1期，這與以往研究[8]結(jié)果相符，說明槲皮素對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖及周期進(jìn)程具有抑制作用。這也通過增殖和細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CDK4和Cyclin D1的表達(dá)降低得到了證實(shí)。STAT3信號(hào)通路參與許多生理活動(dòng)，包括細(xì)胞增殖、遷移、分化、ECM沉積和重塑以及其他信號(hào)傳導(dǎo)途徑的調(diào)節(jié)[9]。有研究[10]報(bào)道了STAT3信號(hào)通路在瘢痕疙瘩形成中的重要作用。近期研究[11]發(fā)現(xiàn)，槲皮素通過抑制STAT3信號(hào)途徑誘導(dǎo)原發(fā)性積液淋巴瘤細(xì)胞凋亡和自噬。本研究結(jié)果表明，槲皮素可降低瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中STAT3和p-STAT3蛋白表達(dá)水平，提示槲皮素可能通過抑制STAT3信號(hào)通路抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖。

綜上所述，槲皮素可以抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖，這些作用涉及STAT3信號(hào)通路。然而，仍需要體內(nèi)研究和前瞻性臨床試驗(yàn)來進(jìn)一步驗(yàn)證槲皮素的治療效果。