超高壓處理對β-伴大豆球蛋白抗原性及結構的影響

李堂昊，布冠好，趙益菲，陳復生

河南工業大學 糧油食品學院，河南 鄭州 450001

大豆富含優質的蛋白質與油脂[1]，但大豆也是公認的八大食物過敏原之一。有研究表明，對大豆過敏的兒童比例高達13%[2]。β-伴大豆球蛋白被認為是引發機體食物過敏的主要成分[3]，其3個亞基均具有致敏性，其中α亞基的致敏性最強，25%的大豆敏感病人的血清能夠識別它，是最早被公認的主要過敏原蛋白[4-5]。國內外對于大豆過敏尚無根本解決辦法，只能依靠避免攝入來防止食物過敏反應的發生。大豆提供氨基酸平衡的高品質蛋白質，常作為原輔料出現在許多食品中，這無疑給大豆過敏人群帶來了潛在威脅[6]。

對于食物過敏，尋找一種有效的加工技術來控制過敏原顯得尤為重要[7]。熱加工可以一定程度地減少過敏原的抗原性，但不能完全清除[8]。近年來，非熱加工技術，特別是超高壓(HHP)技術在食品加工領域廣泛應用。超高壓處理能夠有效延長食品貨架期，且對食品風味與營養價值幾乎沒有影響[9]。目前，國內外學者已將超高壓作為一種有效的非熱加工技術應用于食品中過敏原的消減[10-11]。Li等[12]比較了4種物理方法(微波、高強度超聲、高壓均質化和超高壓)對嬰兒配方奶粉中大豆分離蛋白致敏性的影響，發現4種方式均能在一定程度上消減大豆分離蛋白與過敏患者血清的結合能力，超高壓的消減效果最佳，達到46.6%。Meinlschmidt等[9]提出在風味蛋白酶水解前施加500 MPa的超高壓處理，使大分子的蛋白質水解成小分子的肽，破壞了原有的抗原表位，使處理后的樣品幾乎檢測不出β-伴大豆球蛋白的免疫反應性。Xi等[13]研究表明，經過400 MPa超高壓處理15 min，β-伴大豆球蛋白的抗原性降低了40%。因此，超高壓處理可能是降低大豆蛋白免疫特性的一種有效方法。

不同超高壓處理條件對β-伴大豆球蛋白的抗原性與結構的影響研究較少，且兩者間的構效關系尚不明確。作者通過等電點冷沉法提取β-伴大豆球蛋白，設置不同的超高壓條件對其進行處理，利用Western-Blot與ELISA法定性和定量分析β-伴大豆球蛋白的免疫活性，通過SDS-PAGE、紅外光譜與熒光光譜表征處理前后β-伴大豆球蛋白結構的變化，探究超高壓處理前后β-伴大豆球蛋白免疫活性與結構的相關性，為超高壓進一步應用于消除食源性過敏原提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

脫脂大豆粉：河南省鯤華生物技術有限公司；β-伴大豆球蛋白標準品(C5868)、HRP-羊抗兔IgG(A6154)：Sigma公司；兔抗β-伴大豆球蛋白血清：實驗室自制；牛血清蛋白(BSA)：北京索萊寶科技有限公司；凝膠電泳試劑盒：武漢博士德生物工程有限公司；其他試劑均為市售分析純。

1.2 主要儀器與設備

熒光分光光度計：美國Varian公司；恒溫生化培養箱：上海一恒科技有限公司；超高靜壓裝置：包頭科發有限公司；傅里葉紅外光譜儀、酶標儀：美國賽默飛世爾儀器有限公司；電泳裝置：北京市六一儀器廠；高速冷凍離心機：上海安亭科學儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 蛋白的制備

β-伴大豆球蛋白的提取采用一種優化過的方法[14-16]。料液比(g/mL)為1∶15，脫脂大豆粉與0.03 mol/L的Tris-HCl緩沖液(pH 8.5)在45 ℃下浸提1 h，離心(4 ℃，10 000 r/min，20 min)取上清液。加入0.01 mol/L NaHSO3和5 mmol/L CaCl2，調節pH值至6.4，4 ℃過夜，離心后取上清液。調節pH值至5.5，攪拌1 h，離心取上清液。加入等體積冰水，調節pH至4.8，離心后的沉淀為β-伴大豆球蛋白。0.03 mol/L的Tris-HCl復溶，4 ℃透析2 d，凍干后備用。

1.3.2 超高壓處理

用磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)溶解β-伴大豆球蛋白，真空密封后進行超高壓處理。試驗因素設置為超高壓壓強、加壓時間以及蛋白質量濃度。超高壓處理條件：當蛋白質量濃度與加壓時間分別為5 mg/mL和20 min時，壓強范圍為100～600 MPa；蛋白質量濃度與壓強分別為5 mg/mL和500 MPa，時間范圍為5～30 min；壓強與加壓時間分別為500 MPa和20 min，蛋白質量濃度范圍為5～30 mg/mL。

1.3.3 SDS-PAGE分析

參照趙益菲等[8]的方法對樣品進行SDS-PAGE分析。

1.3.4 ELISA法

采用間接競爭ELISA法測定超高壓處理后抗原性的變化[17-18]。標準抗原用50 mmol/L的碳酸鹽緩沖溶液(pH 9.6)稀釋至0.4 μg/mL(由前期試驗確定)，100 μL/孔包被于96孔酶標板中，樣品與兔抗血清(1∶6 400稀釋)混合，4 ℃過夜。接下來的試驗流程與趙益菲等[8]的一致。吸光度(OD)用酶標儀測定，OD=OD450-OD620，其中OD450和OD620表示在450 nm和620 nm波長下測得的吸光度。樣品抗原性的大小用抗原抑制率表示，抗原抑制率越大表示樣品具有的抗原性越高。

抗原抑制率/%=(1-OD/OD0)×100,

式中：OD為樣品吸光度;OD0為無競爭體系的吸光度。

1.3.5 Western-Blot法

通過Western-Blot法分析β-伴大豆球蛋白的免疫原性[19]。

1.3.6 FTIR分析

試驗參考趙益菲等[8]的方法。樣品紅外光譜用Peak fit 4.12軟件分析，得到蛋白質二級結構的含量[20]。

1.3.7 熒光光譜分析

β-伴大豆球蛋白表面疏水性指數用8-苯氨基-1-萘磺酸銨鹽(ANS)探針測定[21]。樣品蛋白用10 mmol/L PBS(pH 7.0)稀釋至5 mg/mL，不同處理條件下的樣品用同一PBS緩沖液梯度稀釋成6種稀釋度。4 mL樣品溶液中加入20 μL的ANS溶液(80 mmol/L)，搖勻后測定樣品在390 nm激發波長與470 nm發射波長下的熒光強度。用測得的熒光強度對蛋白質量濃度擬合所作曲線的初始斜率表示表面疏水性指數。

超高壓處理后對β-伴大豆球蛋白進行熒光光譜分析，掃描參數：激發波長設置為390 nm，波長范圍400～600 nm。

1.3.8 數據統計與分析

所有試驗數據均平行測定3次，用平均值±標準差表示。利用SPSS 16.0軟件對試驗數據進行Duncan顯著性分析，P<0.05表示差異顯著，并用OriginPro 8.5軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 β-伴大豆球蛋白的提取

通過凱氏定氮測得提取的β-伴大豆球蛋白的蛋白含量為92.70%，圖1是提取樣品的SDS-PAGE圖譜。提取出的β-伴大豆球蛋白α′、α、β3個亞基條帶清晰，且與SPI中β-伴大豆球蛋的3個亞基位置相符，經Gel-pro analyzer軟件分析，其蛋白純度達到72.68%，提取純度較高，可用于下一步試驗。

M：Marker；SPI：大豆分離蛋白；β-conglycinin：制備的蛋白

2.2 超高壓處理對β-伴大豆球蛋白抗原性的影響

圖2—圖4表示不同超高壓處理條件對β-伴大豆球蛋白抗原性的影響。由圖2可知，隨著處理壓強的增加，β-伴大豆球蛋白在壓強為400 MPa時顯示出最低的抗原性，與未超高壓處理相比，降低了45.30%。圖3表明，β-伴大豆球蛋白的抗原性隨加壓時間的延長呈先降低后升高趨勢。這與Xi等[13]的研究結果相似?？乖越档偷脑蚩赡苁浅邏禾幚硎沟鞍鬃冃?，導致IgG無法識別蛋白質表面的抗原表位，無法誘發超敏反應[22-23]。繼續加大壓強與延長加壓時間反而會增加β-伴大豆球蛋白抗原性，這可能是壓強的增大與加壓時間的延長使蛋白質結構發生改變，原本被掩蓋的抗原表位暴露，抗原性上升[24]。圖4表明，隨著蛋白質量濃度提高，β-伴大豆球蛋白的抗原性持續上升，這可能是由于蛋白質量濃度提升，使作用在蛋白上的壓強減小。由以上結果可知，不同條件的超高壓處理能夠顯著影響β-伴大豆球蛋白的抗原性。

注：圖中不同字母代表的數值之間具有顯著性差異(P<0.05)，圖3、圖4同。

圖3 不同加壓時間對β-伴大豆球蛋白抗原性的影響

圖4 不同質量濃度對β-伴大豆球蛋白抗原性的影響

2.3 超高壓處理對β-伴大豆球蛋白亞基及免疫原性的影響

采用SDS-PAGE與免疫印跡法對超高壓處理后的β-伴大豆球蛋白的亞基組成和免疫原性進行分析。圖5為不同超高壓處理后蛋白的SDS-PAGE圖譜，從圖5可以看出，隨著壓強的增加，β-伴大豆球蛋白的各亞基條帶沒有顯著變化，表明β-伴大豆球蛋白經超高壓處理后亞基的組成并未發生改變。圖6為免疫印跡結果，超高壓處理的β-伴大豆球蛋白(條帶2—7)均出現免疫反應條帶。隨著壓強的增加，出現明顯的顏色變淺現象，但條帶并未完全消失，這說明超高壓處理可以降低β-伴大豆球蛋白的免疫原性。結合前面ELISA的結果可知，隨著壓強的提高，β-伴大豆球蛋白的抗原性和免疫原性會出現一定程度的降低，這可能是由于蛋白質結構的變化使其與抗體結合的能力下降。

M：標準蛋白；SPI：大豆分離蛋白；1：未超高壓的β-伴大豆球蛋白；2：100 MPa; 3：200 MPa; 4：300 MPa;5：400 MPa; 6：500 MPa; 7：600 MPa

1：0 MPa；2：100 MPa；3：200 MPa；4：300 MPa；5：400 MPa；6：500 MPa；7：600 MPa

2.4 β-伴大豆球蛋白二級結構的變化

圖7為β-伴大豆球蛋白在不同超高壓處理條件下的紅外光譜圖。紅外光譜的酰胺Ⅰ(1 600～1 700 cm-1)、酰胺Ⅱ(1 530～1 550 cm-1)和酰胺Ⅲ(1 260～1 330 cm-1)是蛋白質的特征吸收區域[25]。由圖7可知，與未處理的β-伴大豆球蛋白相比，超高壓處理后，3條蛋白質特征吸收區域并未發生明顯的紅移或藍移，但是特征區域的透過率明顯上升，表明經超高壓處理后β-伴大豆球蛋白的結構發生了變化。

與未處理樣品相比，400 MPa超高壓處理時，蛋白二級結構中α-螺旋與β-轉角的含量顯著下降，而無規則卷曲和β-折疊的含量顯著上升。 ELISA結果顯示，400 MPa時β-伴大豆球蛋白的抗原性最低，這表明β-伴大豆球蛋白抗原性的變化可能與二級結構中α-螺旋與β-轉角的含量下降有關。有研究指出，過敏原的抗原表位多位于β-轉角與無規則卷曲結構上[28]，與本研究的結果不同。原因可能是β-伴大豆球蛋白的抗原表位分布不同，文中優勢的抗原表位出現在α-螺旋與β-轉角的結構上。綜上可知，β-伴大豆球蛋白的抗原性與二級結構之間存在著相關性，但是這種關系還有待進一步的研究。

1：0 MPa；2:100 MPa;3:200 MPa;4：300 MPa;5：400 MPa;6：500 MPa;7：600 MPa

表1 超高壓處理后β-伴大豆球蛋白的二級結構含量

注：同一列的不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同小寫字母表示差異不顯著。

2.5 蛋白質表面疏水性及空間結構分析

圖8 超高壓處理β-伴大豆球蛋白的表面疏水性

圖8為β-伴大豆球蛋白的表面疏水性。由圖8可知，表面疏水性隨超高壓處理壓強的增加而上升。表面疏水性在400 MPa時急劇上升，繼續加大壓強，表面疏水性并未有顯著變化。這可能是由于超高壓破壞了蛋白質原有的空間結構，使原本在內部的疏水基團暴露出來，蛋白質的疏水性增加[29]；繼續增大壓強并不能進一步擴大疏水區域，說明此時蛋白結構趨于穩定。圖9為超高壓處理后β-伴大豆球蛋白的熒光光譜圖。熒光光譜顯示最大吸收峰并未發生明顯的藍移或紅移，表明超高壓處理并未顯著改變β-伴大豆球蛋白所處環境的極性。但隨著壓強的增加，熒光強度顯著變化，這表明超高壓處理改變了β-伴大豆球蛋白的三級結構，使得疏水性氨基酸更多地暴露在蛋白質表面。壓強為400 MPa時，大量的疏水性氨基酸暴露，此時處理后的β-伴大豆球蛋白也表現出最低的抗原性，這可能是由于超高壓處理改變了蛋白質空間結構，使蛋白質的構象表位被破壞，從而減少被IgG抗體的識別。也有可能是抗原表位大多存在于親水區域，超高壓處理使大量的疏水區域暴露，從而親水區域減少，抗原表位被掩蓋[28]。綜上可知，超高壓處理后大量疏水性基團暴露，蛋白質空間結構改變，抗原表位被破壞或掩蓋，從而使β-伴大豆球蛋白的抗原性降低。

1：0 MPa；2：100 MPa；3：200 MPa；4：300 MPa；5：400 MPa；6：500 MPa；7：600 MPa

3 結論

超高壓處理能夠顯著改變β-伴大豆球蛋白的抗原性及空間結構。超高壓處理后β-伴大豆球蛋白抗原性發生變化，在400 MPa時抗原性降低最顯著，降低了45.30%。紅外光譜結果表明，超高壓處理使β-伴大豆球蛋白的二級結構發生改變，與未處理樣品相比，400 MPa時α-螺旋與β-轉角的含量顯著下降，而無規則卷曲和β-折疊的含量顯著上升。熒光光譜分析結果顯示，超高壓處理改變了β-伴大豆球蛋白的三級結構，大量疏水區域暴露，可能掩蓋或破壞其抗原表位。本研究分析了不同條件的超高壓處理對β-伴大豆球蛋白抗原性及結構的影響，發現超高壓處理可以改變蛋白質空間結構，可能影響其抗原表位，從而達到調控蛋白過敏原抗原性的目的。該研究為大豆蛋白過敏原的脫敏提供加工方法，為開發低敏性或無致敏性大豆產品提供理論依據。