儲運糧食霉變狀況的現場檢測技術

朱冰潔，翟煥趁，張帥兵，呂揚勇，李 娜，胡元森，蔡靜平

河南工業大學 生物工程學院，河南 鄭州 450001

糧食收獲后如果不能在短時間內進行干燥處理，即有可能發生霉變現象[1-2]。在較高的糧食水分條件下，各種適生的霉菌均可快速生長、繁殖[3-4]，其代謝活動可導致糧食品質發生各種劣變現象[5-6]，甚至產生對人和動物有嚴重危害的真菌毒素[7]。這些霉變糧食對后續環節會產生嚴重的不良影響：在加工過程中為了達到衛生標準，需要采用特殊磨制、分選等方法處理，即使如此，也不能完全消除霉變對產品品質的影響[8-9]；進入儲藏環節后，霉變糧的儲藏穩定性差，更易吸濕、發熱，從而影響其他正常糧食的儲藏安全，增大儲糧污染真菌毒素的風險[10-11]。 因此，為了保障糧食儲藏安全和相關食品的食用安全性，人們一直致力于研發糧食霉變狀況的快速檢測方法[12-14]，目的是在糧食交易、收購入庫及加工生產等環節中能夠用于現場即時判斷糧食的霉變狀況。

檢測糧食霉菌的經典方法是平皿培養計數法，該方法操作耗時長，不能滿足現場檢測糧食的“即時”性要求[15]。借助于電檢測或圖像掃描技術雖然可以快速識別霉變的糧食，但這類方法受糧食品種、色澤及顆粒擺放等因素影響，檢測誤差相對較大，尤其對于初始發生霉變的糧食，外觀不一定有明顯變化，而糧食品質可能已經發生劣變或已經污染真菌毒素，從而使檢測結果與實際狀況有較大的偏差[16]?，F有基于分子生物學的PCR檢測技術、基于仿生學的電子鼻檢測技術等均具有較高的檢測靈敏度及準確度，但這些方法需要較復雜的前處理及對檢測環境有較高的要求，很難在現場檢測中應用[17-18]。本課題組前期研究已經發現，糧食及其加工品中的微生物含量與過氧化氫酶活性具有顯著的相關性，處于生長狀態的微生物具有更高的過氧化氫酶活性[19]。通過構建糧食霉變狀態與酶活性的確切關系，尤其在現場檢測適合度等方面，通過改變設備組合，優化、簡化檢測程序，提高檢測速度，即可建立適用于倉庫、碼頭等現場的快速檢測技術，實現對糧食霉變狀態的快速評估，有效管控進入儲運環節的糧食品質。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小麥購于河南省周口市，品種為周麥28、浚麥2018和矮抗58；稻谷分別購于河南省信陽市(秈稻)和新鄉市(粳稻)。配置培養基及用于酶活性檢測的試劑均為市售分析純試劑或生化試劑。

HL-WJC-Ⅲ型過氧化氫酶活性檢測儀：成都華糧倉儲設備有限公司；KMF 720型恒溫恒濕培養箱：德國Binder GmbH公司；HY-4調速多用振蕩器：江蘇中大儀器科技有限公司；VM0 181 A型食物攪拌機：Vita-Mix機器制造公司。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基：參照GB 4785.15—2016配制。改良查氏培養基：蔗糖3%，硝酸鈉0.2%，氯化鉀0.05%，硫酸鎂0.05%，磷酸二氫鉀0.1%，硫酸亞鐵0.001%，氯化鈉6%，瓊脂2%，121 ℃高壓蒸汽滅菌。

1.2 方法

1.2.1 糧食水分的檢測與調節

按照GB 5009.3—2016檢測糧食水分含量；按照1.15～1.20倍理論加水量噴霧糧食，在4 ℃下平衡48 h，獲得試驗所需糧食。

1.2.2 過氧化氫酶活性檢測

將100 g糧食樣品進行不同方法的洗滌處理，收集、定容洗滌液至500 mL作為檢測液，用于分析過氧化氫酶活性。將檢測液加入反應器，加熱到指定溫度，加入質量分數為30%的H2O2溶液10 mL，密閉反應罐，開始檢測，當達到設定檢測時間后，顯示屏中數值即為樣品的酶活性。過氧化氫酶活性定義：在測定條件下傳感器產生1 μA電流的酶量為1酶活性單位。

1.2.3 平皿培養法檢測

按照GB 4789.15—2016霉菌檢測方法進行，采用“馬鈴薯葡萄糖瓊脂”與“改良查氏培養基”在28～30 ℃的培養箱中培養7 d進行菌相鑒定和帶菌量計數。

1.2.4 霉變糧食感官評價

依據GB 2715—2016中對霉變粒的定義，并以GB/T 5494—2008中不完善籽粒的檢測方法為基礎，對不同霉變程度的糧食進行感官評價。

1.2.5 檢測液制備方法

常規振蕩法：將待測糧食樣品100 g裝入500 mL帶玻璃塞的三角瓶中，加入300 mL蒸餾水，將振蕩器調節到最高速振蕩30 min，濾出洗滌液至500 mL量筒中，再加入200 mL蒸餾水沖洗糧食樣品和濾網1次，過濾到量筒中，并補足液體至500 mL作為檢測液。

多次振蕩法：按照參考文獻[20]的方法制備檢測液。

高速攪拌法：將待測糧食樣品100 g裝入到高速攪拌器的攪拌杯中，加入500 mL蒸餾水，調節所需的攪拌速度，設定攪拌時間，攪拌停止后將洗滌液過濾到量筒中，用蒸餾水補足至500 mL。

1.2.6 數據分析方法

采用SPASS 20和Excel 2013軟件進行數據分析。

2 結果與討論

2.1 過氧化氫酶法檢測糧食霉變度的適用性

腐生型霉菌是威脅糧食儲運安全的主要微生物類群，其代謝活動可造成糧食品質不可逆的損毀。對小麥、稻谷幾種高水分糧食樣品進行霉變試驗，用GB 4785.15規定的“霉菌平皿計數法”進行檢測，糧食所含優勢菌的菌相比例如圖1所示。糧食中滋生的霉菌以曲霉屬和青霉屬的種群為主，其優勢菌種主要有灰綠曲霉、黃曲霉、棕曲霉、黑曲霉、青霉等。這一結果與檢測玉米等品種，或在不同試驗條件下檢測各種霉變糧食得到的數據相似[19]。當糧食水分含量不同時，攜帶的主要霉菌種群結構比例會發生相應地變化，例如，小麥樣品中灰綠曲霉菌的比例隨著糧食水分含量升高而下降，黃曲霉、黑曲霉等中生性霉菌的比例則逐漸增高，在高水分的小麥中甚至會出現毛霉等濕生性的霉菌。從圖1還可看出，在較高水分含量的糧食中，青霉、曲霉類霉菌的生長還導致以鏈格孢霉、枝孢霉等為主“其他”類群霉菌所占比例減少?？梢哉故炯Z食中所含霉菌的種群狀況是“霉菌平皿計數法”技術的優勢，有助于了解糧食品質的變化程度和發展趨勢，判斷糧食儲藏的穩定性[11]。但復雜的檢測操作和5～7 d的檢測時間難以在現場應用。

注：A為小麥，水分含量14.6%；B為小麥，水分含量16.2%；C為稻谷，水分含量15.8%；D為稻谷，水分含量18.1%。儲藏條件為儲藏時間20 d，儲藏溫度30 ℃。

針對圖1顯示的霉變糧食所含優勢菌及已知儲糧霉菌的“好氧型”特性，“現場檢測”通過過氧化氫酶法進行間接檢測是適用的。前期研究表明，洗滌糧食籽粒獲得菌懸液，進行過氧化氫酶活性檢測，可以建立酶活性與糧食帶菌量的聯系；而且酶活性檢測還可以判斷霉菌的代謝活躍程度[15]，這是霉菌破壞糧食品質最具相關性的因素[20]；更為重要的是酶活性檢測整個操作過程可在30 min內完成，符合糧食現場檢測對快捷性的要求。雖然酶活性檢測方法不能分辨糧食中存在的霉菌種群，但這一特征并不影響對檢測糧食霉變狀態的判斷。當糧食收獲后進入儲運等環節，糧食品質變化程度僅與霉菌的代謝活動相關，任何在糧食上生長代謝的微生物種群都會對糧食品質產生破壞性作用，任何存活在糧食中的非代謝狀態微生物均沒有實質性的危害作用。根據糧食洗滌菌懸液的酶活性檢測值，不僅可以了解糧食中微生物的活動狀況，還能評估糧食品質受到微生物破壞的程度及對后續工藝環節的影響。因此，選用酶活性間接檢測方法具有顯著的技術優勢。

2.2 選擇檢測液制備方法

制備檢測液是“酶活性”檢測法的關鍵步驟之一。糧食攜帶微生物被洗脫的程度直接影響檢測結果。盡管任何一種制備方法均不可能使所攜帶的微生物全部進入檢測液中，但可以設法使糧食攜帶菌的洗脫比例達到一個穩定值，這是提高檢測可信度、降低檢測值標準差的基本準則。根據檢測的要求，不僅制備檢測液的設備要具有便攜和可以現場操作的特點，還要在力求精確的前提下盡可能縮短操作時間。另外，糧食籽粒各部分本身也含不同量的過氧化氫酶，為了保證檢測效果，應該避免在制備檢測液的過程中將糧食組織的酶活性成分帶入洗脫液中。

根據食品中霉菌帶菌量檢測的國家標準(GB 4789.15—2016)，檢測液的制備采用三角瓶振蕩或均質袋拍擊方法。糧食為硬度較大的顆粒狀物料，檢測一般選用三角瓶振蕩法。常規的操作方法是一次性振蕩30 min，也可采用短時間、多次振蕩洗滌法制備(3次、每次振蕩3 min)。但振蕩器通常體積較大，搬動或安放的難度較大。本試驗選用一種高速攪拌機用于制備檢測液，其基本的要求是能夠將糧食籽粒中的攜帶菌分離到液相中制成檢測液，同時也需要縮短制取的時間，提高檢測效率。對幾種檢測液制備方法進行比較(表1)，表明高速攪拌法制備檢測液耗時是常規方法的1/20～1/10，而且檢測值的變異系數最小，與“平皿計數”國標檢測方法的檢測值相關性系數最高(R=0.98)，說明高速攪拌法更適合用于過氧化氫酶法快速檢測糧食的霉變狀況。

表1 糧食檢測液制備方法比較

當霉菌在糧食籽粒表面生長時，最容易被入侵的部位是胚部，霉變嚴重時可擴展到整個籽粒的其他部分。對于不同的檢測液制備方法，霉變程度的差異對菌體的洗脫效果可能產生顯著的影響。選擇振蕩法中效果較好的多次振蕩法與高速攪拌法對各種霉變程度的糧食進行檢測試驗，結果見圖2。當糧食沒有發生霉變時，兩種檢測液制備方法沒有顯著差異(P>0.05)，當糧食霉變程度增加后，采用高速攪拌法制備的檢測液酶活性值更高，說明其洗脫霉菌的效果高于普通振蕩法，但兩種方法最終的酶活性檢測值相關性系數達到0.99，說明高速攪拌法用于檢測糧食的霉變程度是可靠的。

注：攪拌法，2 300 r/min，1 min；多次振蕩法，康氏振蕩器，30 min。

2.3 影響高速攪拌法制備檢測液的因素

對同一小麥樣品(正常品質)用不同的攪拌轉速(攪拌時間1 min)進行檢測液制備，檢測過氧化氫酶活性及小麥籽粒表面破損率的變化，結果見圖3， 當攪拌轉速超過2 300 r/min，檢測液酶活性及小麥籽粒表面破損率呈現同步快速升高趨勢，通過回歸分析可發現兩者均遵循指數函數升高的模式，相應函數式分別為y=0.717 e1.62x和y=0.015 e2.05x，試驗結果與回歸函數式的相關性系數均達到0.99。這一規律說明，強烈的高速攪拌可使糧食皮層或籽粒其他組織進入到洗脫液中，過氧化氫酶活性以指數形式快速升高是糧食籽粒組織進入檢測液所引起的。雖然各種洗脫方法無法完全避免帶入部分糧食組織，但只要帶入的糧食組織足夠少就不會影響對糧食霉變狀況的判斷，當攪拌轉速2 300 r/min時僅有3%的糧粒表面有損傷痕跡，酶活性的檢測值與振蕩法相比屬于正常糧食的酶活性范圍[20]，說明洗脫的糧食組織沒有顯著影響檢測液的酶活性值，因此，可將2 300 r/min作為制備檢測液的優選轉速。

圖3 攪拌速度對檢測液酶活性的影響

攪拌時間也是影響檢測液酶活性檢測值的重要參數之一。在2 300 r/min下分別以不同的攪拌時間制作檢測液，結果見圖4。 兩種帶菌狀態的小麥在攪拌時間達到40 s后，檢測液酶活性檢測值均進入一個平臺，與攪拌50 s的檢測值差異不顯著(P>0.05)，表明沒有必要繼續延長攪拌時間，以免使糧粒表面的破損率升高。

圖4 攪拌時間對檢測液酶活性的影響

由于糧粒組織具有較高的過氧化氫酶活性，制備檢測液時還應排除相關的影響因素。對兩份不同來源的小麥樣品進行試驗，表明如果檢測時糧食樣品在水中浸泡的時間有差異，對酶活性檢測值可產生非常顯著的影響。在所有檢測過程相同的條件下，糧食在水中浸泡的時間與相應的檢測液酶活性成正比，即使在攪拌制作檢測液前加水靜置僅2 min，其檢測值也分別升高27%和44%(圖5)。酶活性的提高是糧粒組織進入檢測液所致，其原因顯然是水的浸泡促進了糧粒軟化，糧粒組織更易在攪拌過程中破損而進入檢測液。

注：攪拌轉速2 300 r/min，攪拌時間40 s。

2.4 檢測不同糧食種類及品種的差異性

對新收獲、品質正常的3個常見小麥品種和兩種稻谷進行過氧化氫酶和帶菌量的檢測比較，結果見圖6，這些糧食樣品的平板計數法檢測帶菌量均沒有超過104cfu/g，符合正常新收獲糧食的帶菌量特征；過氧化氫酶活性檢測值也均在正常值以內，但帶菌量與過氧化氫酶活性值之間沒有表現出固定的比例關系。這一現象與用振蕩法制備檢測液獲得的各糧食品種過氧化氫酶活性與霉菌帶菌量呈極顯著相關性(R≥0.99)的結果有所差異[19]。導致這種差異的因素應該是快速攪拌操作將少量的糧食組織帶入檢測液中。不同種類或品種的糧食表面致密度不同，攪拌過程帶入檢測液的糧食組織數量也有差異，使得酶活性檢測值發生相應的變化。只要在檢測液制備過程中總體控制好帶入的糧食組織比例，對于檢測糧食的霉變狀態不會產生明顯的影響。

注：攪拌轉速2 300 r/min，攪拌時間40 s。

進一步對發生霉變過程的各種糧食進行檢測比較，研究攪拌法對糧食發生霉變現象檢測的效果，結果表明，水分含量16%小麥在20 ℃儲藏12 d期間，過氧化氫酶活性與霉菌帶菌量檢測值之間具有極顯著的相關性(R=0.99)(圖7)。在對小麥霉變判斷的靈敏度上，酶活性檢測在第9天已經超出正常值((797±42) U/100 g)，帶菌量檢測法則在第12天才顯著超過正常值((3.0±0.6)×104cfu·g-1)。對稻谷霉變期間的監測也得到相似的結果(圖8)，兩種方法也分別在第9天和第12天檢測出其數值超過正常糧食的范圍。這一結果說明酶活性檢測法可以靈敏反映糧食中霉菌數量增加的變化，雖然攪拌法可在檢測液中帶入具有酶活性的糧粒組織，但其比例是穩定可控的，不會掩蓋霉菌生長使過氧化氫酶檢測值升高的表現，因此，該方法對于糧食霉變度檢測具有較好的適用性。

注：小麥水分含量16%，儲藏溫度20 ℃。

注：稻谷水分含量17%，儲藏溫度20 ℃。

2.5 酶活性檢測用于現場快速檢測的效果

現有糧食收購環節對糧食霉變程度的檢測按照GB 2715—2016實施。霉變粒是指粒面明顯生霉并傷及胚或胚乳或子葉、無食用價值的顆粒。在糧食收購環節要完全按照這個標準去檢測是難以做到的，不僅需要耗費大量的時間，而且檢測者的人為因素對檢查結果影響也非常大。

從霉變小麥中嚴格按照要求挑選出小麥霉變粒，以一定的比例取代樣品中的正常小麥，用帶菌量檢測法與過氧化氫酶快速檢測法進行檢測試驗，結果見圖9，兩種方法均能對不同霉變粒比例的小麥進行良好的甄別，當霉變粒達到2%的臨界指標時，過氧化氫酶活性和帶菌量的檢測均值分別為527 U/100 g和1.6×105cfu/g，均屬于霉變糧的取值范疇。對數據進行分析可知，不同小麥霉變粒比例與兩種檢測方法的檢測值均呈線性相關，線性相關系數分別為酶活性檢測0.99、帶菌量檢測0.97；兩種檢測方法檢測值的相關系數為0.96。因此，酶活性檢測在糧食快速檢測時的實際效果與經典的帶菌量檢測法基本相當。

圖9 不同比例小麥霉變粒的檢測效果

3 結論

在收購、調運等環節現場檢測糧食的霉變狀況時，現有檢測方法均存在耗時長、誤差大等不足。本研究對霉變糧食中主要菌相和比例變化進行了分析，表明糧食在適合霉菌生長的環境中主要以青霉、曲霉為主要增量菌，對糧食霉變狀況的評估可簡化為以霉菌數量變化作為唯一指標，適合應用過氧化氫酶活性快速檢測方法。酶活性檢測方法試驗表明，快速攪拌法具有明顯的優勢，通過對攪拌制作檢測液的轉速、攪拌時間等影響因素的系統分析和優化，使該檢測方法具備耗時更短、檢測結果更加穩定、靈敏等特征，可實現在糧食儲運現場對糧食的霉變狀況進行準確評估。因此，本研究構建的檢測工藝解決了糧食收儲環節迫切需要進行糧食霉變狀況評估與現有國標方法不能快速、準確檢測的矛盾，為保障糧食的儲藏穩定性和食用安全性提供必要的技術手段。