葡萄膜黑色素瘤的免疫細胞浸潤類型與預后分析

林敏，吳文捷

(福建醫科大學省立臨床臨床醫學院，福建 福州)

0 引言

葡萄膜黑色素瘤(Uveal melanoma，UM)是一種起源于眼睛脈絡叢中的黑色素細胞的惡性腫瘤，易向肝臟轉移[1]。與其他惡性腫瘤類似，在UM 中，分子機制不明，死亡率高和治療困難等問題依然是困擾臨床醫生的難題。目前，UM 的治療主要以手術為主，而由于缺乏良好的預后診斷生物標志物，使得UM 的治療效果非常有限[2]。相關研究表明[3,4]：淋巴細胞、巨噬細胞和CD3+ T 細胞等與UM 患者的預后明顯相關。然而目前，關于UM 中免疫細胞浸潤的分子機制尚不清楚，因此很難評估免疫細胞對于腫瘤發生發展過程中所發揮的作用。CIBERSORT 是一種從復雜的基因表達譜中描述其細胞組成的方法[5]，我們使用該方法能夠分析得到UM 中免疫細胞的浸潤情況，并使用TIMER 分析了免疫細胞與預后的關系，還使用TIMER 分析了UM 中突變率最高的基因和體細胞突變與免疫細胞的相關性。該研究不僅為進一步研究UM 的分子機制提供了新的思路，而且為UM 提供了可供參考的預后生物標志物和治療靶點。

1 材料與方法

1.1 數據下載

GEO(Gene Expression Omnibus，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)[6]是一個國際公共基因數據庫，收集了大量的疾病功能基因組數據集。我們用R 語言GEOquery 包[7]從GEO 數據庫中下載并分析樣本來源可靠的UM 表達譜數據集GSE27831和GSE22138，兩數據集物種來源均為人類，平臺均基于GPL570([HG-U133_Plus_2] Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array)。其中GSE27831 數據集包括轉移性黑色素葡萄膜瘤組織樣本11 例和非轉移性黑色素葡萄膜瘤組織樣本18 例，而GSE22138 數據集則包括35 例轉移性黑色素葡萄膜瘤組織樣本和28 例非轉移性葡萄膜黑色素瘤樣本。

1.2 免疫細胞浸潤的評估

CIBERSORT(https：//cibersort.stanford.edu/) 是一個利用基因表達譜數據計算免疫細胞類型和豐度的在線工具。我們使用R 語言中affy 包[8]對數據集GSE27831 和GSE22138 中的CEL 文件通過RMA 算法進行背景校正、數據歸一化處理，并使用sva 軟件包[13]去除批次效應。應用GPL570 平臺注釋信息在Bioconductor(http：//www.bioconductor.org/) 對探針矩陣進行注釋。最后我們將準備好的基因表達矩陣上傳到CIBERSORT，得到免疫細胞浸潤矩陣，篩選標準：P＜0.05。

1.3 免疫細胞浸潤的可視化及評價

圖1 免疫細胞浸潤矩陣二維PCA 聚類圖和免疫細胞相關性熱圖

主成分聚類分析(Principal component analysis，PCA)[9]是多維度數據降維常用的方法，其主要是通過獲取數據的主要投影方向來實現數據向主要特征方向上的映射，從而達到數據降維的效果。我們使用R 語言對免疫細胞浸潤矩陣進行PCA 聚類，并繪制二維PCA 聚類圖展示兩組之間免疫細胞浸潤的差異。R 語言corrplot 包繪制相關熱圖以展示22 種免疫細胞浸潤的相關性；ggplot2 包[10]繪制小提琴圖用于展示22 種免疫細胞浸潤的差異；igraph 包[11]繪制免疫細胞浸潤的相關網絡圖以展示22 種免疫細胞浸潤的互作情況，以P＜0.05、｜相關系數｜＞0.15 為互作標準。

1.4 TIMER 數據庫相關分析

TIMER(https：//cistrome.shinyapps.io/timer/) 是一個用于系統分析各種癌癥類型的免疫細胞浸潤的在線工具，其可通過動態顯示圖展示多種腫瘤的免疫學、臨床和基因組特征[12]。使用TIMER數據庫能夠對分析得到的UM 的免疫浸潤結果進行初步驗證。我們使用TIMER 對免疫細胞與UM 患者預后的關系進行了檢測。目前，人們普遍認為基因突變和遺傳是腫瘤形成的關鍵因素，因此我們使用TIMER 對UM 中突變率最高的3 個基因(GNAQ、GNA11 和BAP1) 和2 個免疫治療熱點基因(CD274 和CD279) 的拷貝數變異與免疫細胞的相關性進行了分析。

2 結果

2.1 葡萄膜黑色素瘤免疫細胞浸潤的相關性分析結果

我們使用CIBERSORT 分析得到UM 中免疫細胞浸潤的矩陣。免疫細胞浸潤的PCA 分析結果表明(圖1A)：兩樣本能夠明顯分開，表明兩組中免疫細胞浸潤的情況具有明顯的差異。免疫細胞相關性熱圖表明(圖1B)：漿細胞與輔助T 細胞、調節T 細胞和單核細胞呈正相關，而漿細胞與gamma T 細胞、M1 巨噬細胞和肥大細胞呈負相關；CD8+ T 細胞和輔助T 細胞、gamma delta T 細胞和NK 細胞呈明顯正相關，而CD8+ T 細胞與M0 巨噬細胞和M2 巨噬細胞和靜息肥大細胞呈明顯負相關；CD4+ 記憶T 細胞與輔助T細胞呈明顯負相關；輔助T 細胞與NK 細胞和靜息樹突狀細胞呈明顯正相關，而輔助T 細胞與M0 巨噬細胞和靜息肥大細胞呈明顯負相關；輔助T 細胞與單核細胞呈明顯正相關，而輔助T 細胞與gamma T 細胞和M1 巨噬細胞呈明顯正相關；gamma T 細胞與M1巨噬細胞呈明顯正相關，而gamma T 細胞與M2 巨噬細胞和靜息樹突狀細胞呈明顯負相關；NK 細胞與M0 巨噬細胞呈明顯負相關；M0 巨噬細胞與嗜酸性粒細胞呈明顯正相關；M1 巨噬細胞與活動肥大細胞和中性粒細胞呈明顯正相關，而M1 巨噬細胞與靜息樹突狀細胞呈明顯負相關；靜息樹突狀細胞與中性粒細胞呈明顯正相關。

2.2 免疫細胞浸潤的豐度與相互作用結果

使用小提琴圖對免疫細胞浸潤的豐度進行監測，結果表明(圖2A)：漿細胞、調節T 細胞、NK 細胞、靜息樹突狀細胞和活動樹突狀細胞在轉移性葡萄膜黑色素瘤中浸潤較多，而CD4+ T 細胞、CD4+ 記憶T 細胞、輔助T 細胞、gamma T 細胞、M0 巨噬細胞、M1巨噬細胞和中性粒細胞在轉移性葡萄膜黑色素瘤中浸潤較少。通過疫細胞互作網絡圖(圖2B)結果表明M1 巨噬細胞、NK 細胞和CD8+ T 細胞與其他細胞關系最為密切。

2.3 免疫細胞浸潤與患者預后的關系

通過TIMER 分析B 淋巴細胞、CD8+ T 細胞、CD4+ T 細胞、單核細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞與患者預后的關系，結果表明( 圖3)：CD8+ T 細胞浸潤較多提示患者預后較差(Log-rank P=0.001)，而中性粒細胞浸潤較多提示患者預后良好(Log-rank P=0.005)。

2.4 TIMER 數據庫相關分析

我們通過TIMER 數據庫分析得到在UM 中突變率最高的基因為BAP1、GNA11 和GNAQ。3 個基因與免疫細胞浸潤相關性分析結果表明(圖4)：BAP1 突變與CD8+ T 細胞和中性粒細胞密切相關。我們通過TIMER 數據庫探索UM 中CD274 和CD279 與6 種免疫細胞相關性的結果表明(圖5)：CD274 與CD4+ T 細胞和中性粒細胞相關，而CD279 與CD8+ T 細胞和巨噬細胞相關。

3 討論

UM 成人眼內常見的惡性腫瘤，易與多種眼內疾病混淆。早在1980 年，Sunba 等早已表明免疫反應與腫瘤的組織學特征存在明顯的相關性[13]。之后隨著人們對于UM 發病過程中免疫細胞浸潤機制的研究，免疫指標早已經用于UM 診斷和預后的評估，針對免疫逃逸機制的免疫療法也逐漸進入人們的視野[14,15]。在揭開UM中免疫浸潤機制的過程中，多種免疫細胞在UM 中的作用逐漸被揭露。Gartrell 等研究表明[16]，調節性T 細胞在原發性UM 中發揮著重要的作用。Falleni 等研究表明[17]，M1 巨噬細胞轉型為M2巨噬細胞有利于UM 的侵襲和轉移。這些免疫細胞不但在UM的發展過程中發揮著重要的作用，而且與患者的臨床預后密切相關[18]。目前，由于人們對于UM 發展過程中免疫機制的認識仍然處于探索階段，因此UM 的免疫治療一直很難取得突破性的進展。所以我們利用CIBERSORT 這項新的技術，通過對UM 的基因表達譜數據進行分析，從而得到UM 侵襲轉移過程中免疫細胞的浸潤情況，并分析了免疫細胞浸潤與患者預后的關系，也分析了UM中高突變基因和體細胞突變基因與免疫細胞浸潤的關系。

我們使用CIBERSORT 對數據集GSE27831 和GSE22138 中的基因表達譜數據進行反卷積算法，結果表明漿細胞、調節T 細胞、NK 細胞、靜息樹突狀細胞和活動樹突狀細胞、CD4+ T 細胞、CD8+ 記憶T 細胞、輔助T 細胞、gamma T 細胞、M0 巨噬細胞、M1 巨噬細胞和中性粒細胞的浸潤在兩組中存在明顯差異。Bronkhorst 等[19]通過免疫組化實驗表明CD4+T 細胞、CD8+ T 細胞和M2 巨噬細胞在UM 中存在浸潤的情況。Nagarkatti-Gude等通過免疫熒光實驗表明[20]：在UM 的腫瘤微環境中，IL-6 和IP-10 可促進調節性T 細胞浸潤。NK 細胞可以直接吞噬和裂解UM 細胞，因此不但具有控制UM 細胞增殖的作用，而且可以抑制UM 從眼向肝轉移[21-23]。M1-M2 型巨噬細胞的轉化在UM 侵襲轉移中發揮重要的作用[17]，因此M1 性巨噬細胞在侵襲性UM 中浸潤較少，這與我們分析的結果類似。樹突狀細胞在UM 免疫機制中起著抗原提呈的作用，是激活CD4+ T 細胞和CD8+ T 細胞必不可少的一步，UM 細胞可通過抑制樹突狀細胞的活性來逃避免疫系統的破壞[24,25]。以上的研究與我們預測的結果一致，這說明我們對于UM 中免疫細胞浸潤情況的分析具有一定的可信度。因此我們推測漿細胞、gamma T 細胞、M0 巨噬細胞和中性粒細胞等尚未報道的細胞可能在UM 的微環境中也發揮著重要的作用，有待我們進一步的生物實驗驗證。

圖2 免疫細胞浸潤豐度和相互作用網絡

圖3 TIMER 數據庫分析6 種免疫細胞與患者預后的關系

圖4 TIMER 數據庫中突變率最高的基因與6 中免疫細胞的相關性分析圖。A-C 圖分別為BAP1、GNA11、GNAQ 與6 種免疫細胞相關性分析圖，藍色代表正常組，紅色代表突變組。

圖5 體細胞突變基因與6 種免疫細胞相關性分析圖。

使用TIMER 數據庫對6 種免疫細胞與UM 患者的預后進行檢測，結果表明CD8+ T 細胞浸潤較多提示患者預后較差，而中性粒細胞浸潤較多提示患者預后良好。CD8+ T 細胞不僅與腫瘤血管生成有關，而且可以促進M1 型巨噬細胞轉向M2 型巨噬細胞，因此與腫瘤的預后不良明顯相關[19,26]。關于CD8+ T 細胞和UM患者預后的關系與我們的分析結果一致，說明我們對于免疫細胞與患者預后關系的分析準確可靠。而關于中性粒細胞與UM 患者預后的關系目前尚未報道，有待進一步的研究。

通過TIMER 數據庫檢測突變率最高的基因與6 種免疫細胞關系的結果顯示：BAP1 與CD8+ T 細胞和中性粒細胞關系密切；CD274 和CD279 與6 中免疫細胞結果顯示：CD274 與CD4+ T 細胞和中性粒細胞關系密切，CD279 與CD8+ T 細胞和巨噬細胞關系密切。Gezgin 等研究表明[27]，BAP1 的低表達可以促進CD8+ T細胞的增殖。而我們發現的其他幾個調控關系，目前尚未報道，這有可能幫助我們發現侵襲性UM 腫瘤微環境中新的調控關系。

綜上所述，我們對侵襲性UM 基因芯片進行分析，得到了免疫細胞浸潤的豐度、患者預后和基因突變的關系。可能為我們探索侵襲性UM 的分子免疫機制提供指導，也有助于我們開發侵襲性UM 新的治療方法。