GC-IMS技術(shù)結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法在青稞分類中的應(yīng)用

趙卿宇 沈 群

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院;植物蛋白與谷物加工北京市重點實驗室;國家果蔬加工工程技術(shù)研究中心，北京 100083)

青稞(HordeumvulgareL.var.nudumHook.f.)是禾本科大麥屬的一種禾谷類作物，因其內(nèi)外穎殼分離，籽粒裸露，故又稱裸大麥、元麥、米大麥，主要產(chǎn)自中國西藏、青海、四川、云南等地[1]。青稞具有適應(yīng)性好、抗逆性強、產(chǎn)量穩(wěn)定等優(yōu)點，可食用、釀造或用作牧區(qū)牲畜越冬時的飼料。目前國內(nèi)外對于青稞的研究主要集中在青稞的營養(yǎng)潛力、飼用價值、食品和工業(yè)利用等[2]，而作為青稞品質(zhì)的另一重要特征指標—香氣組分在國內(nèi)外研究甚少，青稞的香氣組分是一類非常復(fù)雜，數(shù)目龐大的物質(zhì)，其化學(xué)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)各不相同。

青稞香氣組分提取常采用頂空固相萃取[3]和同時蒸餾萃取技術(shù)[4]，香氣組分分析常用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[5]。然而傳統(tǒng)的GC-MS法存在同分異構(gòu)體難以鑒別、操作復(fù)雜以及設(shè)備昂貴等缺點，難以在國內(nèi)推廣普及[6]，因此需要開發(fā)一種快速、靈敏、高通量和結(jié)果直觀的鑒定方法。氣相色譜-離子遷移譜(GC-IMS)作為一種新的聯(lián)用技術(shù)，將氣相分析技術(shù)的簡易快捷與離子遷移譜的高分辨、高準確度分析有機融合。GC-IMS不僅克服了IMS分離效率差的局限性，而且充分發(fā)揮了氣相色譜的超高分離效率和離子遷移譜的高靈敏性，該方法目前已成功應(yīng)用于食品風味分析、品質(zhì)檢測等多個領(lǐng)域[7-9]。本研究采用GC-IMS技術(shù)結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法，對29種青稞的揮發(fā)性成分進行統(tǒng)計分析，并采用PCA和Fisher判別分析建立不同青稞的判別模型，以期為青稞風味物質(zhì)的分離鑒定、指紋圖譜的構(gòu)建及風味物質(zhì)的理論研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

29種青稞品種由西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院提供，其中以X2DM開頭的24種為藏大麥品種，剩余5種為藏青2000，藏青320，冬青18，茍籽粒和隆里。

1.2 儀器與設(shè)備

FlavourSpec 1H1-00053 型氣相色譜-離子遷移譜：配CTC CombiPAL自動頂空進樣裝置；交聯(lián)毛細管柱(15 m×0.25 mm×0.50 μm，德國)。

1.3 實驗條件

頂空進樣條件頂空孵化溫度：95 ℃；孵化時間：17 min；加熱方式：振蕩加熱，轉(zhuǎn)速500 r/min；頂空進樣針溫度：98 ℃；進樣量：500 μL，不分流模式；用高純N2(純度≥99.999%)推動和清洗頂空針；清洗時間： 0.5 min。

GC條件色譜柱類型FS-SE-54-CB-115 mI D:0.53 mm；柱溫：40 ℃；運行時間：10 min；載氣(高純N2，純度≥99.999%)；流速：初始5.0 mL/min，保持10 min后在5 min 內(nèi)線性增至150 mL/min。

IMS條件漂移管長度：5 cm；管內(nèi)線性電壓：400 V/cm；漂移管溫度：40 ℃；漂移氣(高純N2，純度≥ 99. 999%)；流速：150 mL/min；IMS 探測器溫度：45 ℃。

1.4 數(shù)據(jù)處理

GC-IMS 在正離子模式下通過有線網(wǎng)絡(luò)傳輸并保存到計算機中，每張譜圖平均掃描32 次，使用網(wǎng)格脈沖寬度為100 μs，重復(fù)率為21 ms，采樣頻率為150 kHz。對樣品揮發(fā)性有機成分的指紋數(shù)據(jù)采用軟件LAV 2.0.0和MatlabR2016b處理完成。

GC-IMS三維譜中特征峰選取原則GC-IMS三維譜中每個特征峰代表1種揮發(fā)性有機成分，以不同樣品中特征峰的有無或者特征峰強度變化為原則，手動選擇并以長方形標記特征峰所在區(qū)域，以該特征峰區(qū)域的峰強度(即特征區(qū)域離子強度的最大值)作為參數(shù)變量進行數(shù)據(jù)分析。

PCA分析和Fisher分類判別采用SPSS22.0軟件和OriginPro9.0軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 29種青稞GC-IMS譜圖分析

如圖1所示，隨機選取三種藏大麥和藏青320、冬青18的GC-IMS譜圖，直觀觀察樣品譜圖之間的區(qū)別。從直觀上看，不同青稞在GC-IMS三維圖譜上存在差異，具體體現(xiàn)在出峰位置、數(shù)量以及對應(yīng)的峰強度。三種藏大麥樣品之間比較相似，而藏青320、冬青與藏大麥之間的差別很大，這為后續(xù)青稞的分類提供了可能。

依據(jù)特征峰選取原則，通過GC-IMS將選取的青稞品種中不同有機揮發(fā)性物質(zhì)對應(yīng)的特征峰區(qū)域進行排序?qū)φ眨玫饺鐖D2所示的指紋圖譜。圖2中X軸為選取的特征峰標識號，Y軸為樣品編號。圖2

圖1 5種青稞的GC-IMS對比圖

圖2 29種青稞樣品揮發(fā)性有機物指紋圖譜對比

表1 分類模型結(jié)果表

注：1為藏大麥系列，2為非藏大麥系列。

每一行代表一個青稞樣品中全部的揮發(fā)性有機物信息，每一列代表同一揮發(fā)性有機物在不同青稞樣品中的信息，每一個點代表一種揮發(fā)性有機物，白色表示濃度較低，紅色表示濃度較高，顏色越深表示濃度越高。通過GC-IMS分析得到的指紋圖譜，可直觀和快速看出29種青稞品種的完整特異性揮發(fā)性有機物以及樣品之間揮發(fā)性有機物含量的差異。

由圖2可知，29種青稞品種所含的香氣組分種類基本相似，但含量差異較大。在24種以X2DM開頭的藏大麥品種中，X2DM0052含有的特異性揮發(fā)有機物較多,其中紫色框中表示X2DM0052的特殊信號峰(含量比其他高)。另外5種青稞品種(藏青2000和320、冬青18、隆里和茍芝粒)中，綠色框中表示藏青2000的特殊信號峰(含量比其他高)；黃色框中表示藏青320的特殊信號峰(峰137含量比其他高很多，而其余兩個比其他較高)；紅色框中表示茍芝籽的特殊信號峰(含量比其他高)。

2.2 主成分分析

通過不同特征區(qū)域的排序?qū)Ρ瓤纱笾屡袆e青稞品種，但仍受限于觀察者的主觀性，無法實現(xiàn)GC-IMS三維譜的數(shù)字化表達。故以選取的特征峰對應(yīng)的峰強度值為特征參數(shù)變量進行主成分分析，得到圖3。由圖3可知，不同青稞品種的GC-IMS數(shù)據(jù)經(jīng)PCA處理后，可以較好地區(qū)分部分類別的青稞品種。以X2DM開頭的24種藏大麥樣品在PCA圖中橫跨區(qū)域范圍較大，這與樣品采集自不同的區(qū)域有關(guān)，間接說明了GC-IMS對青稞產(chǎn)地鑒別的可能性。藏青2000、藏青320、茍籽粒與24種藏大麥樣品可以明顯區(qū)分，其中茍籽粒與藏大麥區(qū)別最大；冬青18和隆里則和藏大麥比較相似，無法做到有效區(qū)分。除此之外，還發(fā)現(xiàn)藏青2000、藏青320、冬青18、茍籽粒和隆里彼此之間距離較大，說明五種青稞在香氣組分上具有明顯的差異。

圖3 29種青稞的主成分分析

2.3 Fisher判別分析

Fisher判別法是先對樣本進行方差分析，將樣本的種類區(qū)分出，然后依據(jù)方差分析的結(jié)果進行線性判別分析，區(qū)分不同個體。Fisher線性識別作為一種分類方法已經(jīng)被成功的應(yīng)用在大米[10]、蕎麥[11]、茶葉[12]等。Fisher判別的優(yōu)勢在于對分布、方差等都沒有限制，應(yīng)用范圍較廣，且依此法建立的判別方程可直接用手工計算的方法進行新觀察對象的判別，非常方便。對29種青稞里面選取的特征峰對應(yīng)的峰強度值進行Fisher分類識別，分別選擇不同品種青稞中的80%樣品作為訓(xùn)練集，20%作為預(yù)測集，建立分類模型，具體情況如表1所示。訓(xùn)練結(jié)果如表2所示，樣品識別正確率為100%。為了全面的檢測模型的預(yù)測能力，本研究選擇結(jié)合預(yù)測集校檢和留一交叉驗證法對建立的模型進行驗證，鑒別結(jié)果見表3。結(jié)果表明，預(yù)測集校驗和留一交叉驗證對模型的檢測結(jié)果分別為85.71%、100%和92.68%、100%。預(yù)測結(jié)果都在85%以上，均達到了定性判別的要求，初步說明該模型穩(wěn)健、可靠，能用于不同青稞品種區(qū)分。

表2 訓(xùn)練集識別結(jié)果

表3 Fisher判別函數(shù)驗證結(jié)果

3 結(jié)論

采用GC-IMS聯(lián)用分析技術(shù)結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法建立了一種簡便、快速、準確的不同青稞種類判別方法。對青稞中的香氣成分進行了分析，GC-IMS圖譜清晰，對比明顯。以GC-IMS三維譜中的特征峰強度作為表征青稞品質(zhì)信息的特征參數(shù)，并使用化學(xué)計量學(xué)方法進行分類判別。結(jié)果表明，藏青2000、藏青320、冬青18、茍籽粒和隆里在香氣組分上具有明顯的差異，其中藏青2000、藏青320、茍籽粒與24種藏大麥可以明顯區(qū)分，而冬青18和隆里則和藏大麥比較相似；建立Fisher判別分析模型，選擇預(yù)測集校檢和留一交叉驗證法對建立的模型進行驗證，訓(xùn)練集的識別率為100%，驗證結(jié)果正確率均在85%以上，達到定性分析的要求，初步表明該模型穩(wěn)健、可靠，能用于不同青稞品種區(qū)分。由此可見，依據(jù)青稞中香氣成分信息對不同青稞進行分類和判別是可行的，GC-IMS技術(shù)可望發(fā)展成為快速高效的青稞指紋信息鑒別技術(shù)。