不飽和脂肪酸經氧化反應形成反式脂肪酸機理研究進展

姚夢瑩 梁 倩 崔巖巖 黃午陽 鄭曉燕 張偉敏

(海南大學食品科學與工程學院1，海口 570228)(江蘇省農科院農產品加工研究所2，南京 210014)(中國熱帶農業科學院海口實驗站3，海口 570101)

食用油中順式不飽和脂肪酸在熱加工過程中可經異構化反應形成反式脂肪酸(trans fatty acids, TFAs)[1，2]。食用油中TFAs種類和含量在160～240 ℃內隨溫度的升高和時間的延長而呈指數增加趨勢[3-5]。眾多研究表明，膳食TFAs與糖尿病、心血管疾病、肥胖、乳腺癌、前列腺癌、不孕和冠心病等疾病密切相關[6]；大量食用含有TFAs 的食物會阻礙必需脂肪酸在人體內的正常代謝、妨礙脂溶性維生素的吸收和利用、使細胞膜的結構變得脆弱、加速動脈硬化等多種危害[7-11]。隨著對 TFAs 危害認識的深入，歐美等國家對 TFAs 加以限制，制定膳食中限量標準。因而，有效控制食用油熱加工過程中TFAs 的產生成為亟需解決的難題，且對于提升食品安全水平和保障消費者健康至關重要。

1 TFAs特點與影響因素

如油酸甲酯、亞油酸甲酯和亞麻酸甘油三酯在160～220 ℃加熱條件下生成TFAs含量隨加熱溫度升高和加熱時間延長而逐漸增加[19]。大豆油、菜籽油和葵花油等植物油也發現了類似的結果[20-23]。此外，TFAs的形成與不飽和脂肪酸組成、含量、結構、飽和度及碳原子數目多少有關。其中不飽和度越高TFAs越易形成；當碳原子數目、不飽和度相同時，反式異構數量越少、對稱性越高的TFAs 越容易產生[24]。

2 不飽和甘油三酯氧化產生反式結構的反應機理

油脂中不飽和脂肪酸的氧化反應又可分為自動氧化和熱氧化兩種，自動氧化和熱氧化二者反應機理相同[25]。但兩種反應發生的過程、反應速度和產物則不盡相同。一般而言，100 ℃以下以自主氧化反應為主；100～200 ℃則會加速氧化反應，并伴隨熱異構化反應(150 ℃條件就有TFAs產生)[26]；溫度在 200～300 ℃時則以熱聚合反應為主，而熱分解反應在260 ℃以下不明顯，在350 ℃以上時反應速度會明顯加快[27]。

2.1 不飽和甘油三酯自由基反應(加成-消除反應)產生反式脂肪酸機理

早期的研究證明，不飽和脂肪酸在含硫自由基(RS*)、烷基自由基(ROO*)等自由基在催化作用下可通過自由基反應機制發生雙鍵的順/反異構化[28,29]。X*與雙鍵經α-加成和β消除反應生成π鍵，最后生成熱穩定的反式異構體(圖1)，反應過程中會形成一個由外源自由基和不飽和脂肪酸組成的加合物[29]。不飽和脂肪酸在自由基的催化作用下亦可以通過自由基反應機制發生雙鍵的順反異構化產生TFAs。反式異構化速率與順式熱降解速率呈正相關，熱致異構化反應與熱氧化降解產生的中間物質和氧化過程有關[11,30,31]。

圖1 自由基催化順式/反式異構化反應機制

圖2 雙自由基過渡態反應機制[33]

2.2 不飽和甘油三酯自動氧化產生反式結構的反應機理

從油酸甲酯自動氧化生成過氧自由基的機理可以看出(圖3)，油酸順/反異構化反應理論計算和實驗證明，氧氣是發生油酸順/反異構化反應的必要條件，R—O—O—H 均裂的活化能為160.97 kJ/mol，是油酸順/反異構化過程的決速步驟，并從油酸角度闡明了不飽和脂肪酸發生氧化反應形成自由基經過β均裂產生TFAs的理論機制[34]。Porter等[35]對油酸甲酯自動氧化生成過氧自由基機理的研究表明，油酸發生順/反異構化過程中，8t、9t、10t及11t結構均有產生，這些反式異構體的產生及產量受到加熱、溫度和時間等諸多因素的影響。同理，TFAs也是亞油酸和亞麻酸熱氧化分解反應中的常見氧化產物。只不過生成TFAs更容易，產物更復雜，除了有TFAs之外，還伴隨有經環化反應形成的一環和二環脂肪酸單體等產物[36]。目前關于不飽和脂肪酸在高溫條件下生成環狀脂肪酸的化學機制最為成熟的解釋是熱引發[1,6]或[1,7]質子異變迀移協同的環加成作用[36]。和油酸類似，亞油酸也是通過自由基鏈式反應機制和1, 3-單鍵轉移重排(分子內)可以解釋亞油酸在高溫條件下形成9t、11t亞油酸和成10t、12t式亞油酸，只是亞油酸比油酸相對更容易形成反式亞油酸[37,38]。由于本研究主要側重于對不飽和脂肪酸形成TFAs機制的探討，因而對不飽和脂肪酸(油酸、亞油酸和α-亞麻酸)在發生順/反異構化過程經高溫反應形成環狀脂肪酸的具體化學機制不做過多贅述。

注：Rc H 是油酸， Rt H 是反式油酸， H 是與雙鍵相鄰的α -亞甲基的氫原子。圖3 油酸自動氧化產生反式結構的反應機理

3 熱致異構化反應機理的密度泛函理論計算

3.1 密度泛函理論可開展酚類抗氧化劑活性理論分析

化學反應過渡態理論認為，不飽和脂肪酸熱致異構化過程形成的過渡態性質非常活潑，存在時間極短，從實驗獲得它的結構和性質等數據很難[5]。而量子化學密度泛函理論則為不飽和脂肪酸熱致異構化機制研究提供了可能，并在分子反應機理和過渡態的處理上體現出了無與倫比的優越性[16,39-43]。近年來，國內外學者報道了利用量子化學手段研究不飽和脂肪酸(油酸、亞油酸和亞麻酸)的順反異構化機制[5,16,38,42]。

3.2 不飽和脂肪酸氧化脫氫反應能量的量子化學計算

食用油中不飽和脂肪酸或甘油酯中的α碳上的氫原子發生脫氫而在起始階段產生脂烷基自由基。十八碳一烯酸(油酸)有2個α碳原子(即C8和C11)；十八碳二烯酸(亞油酸) 應當有3個α碳原子，即C8、C11和C14，但是由于C11受到兩個雙鍵的影響，它的活性要比C8和C14要強得多；作為十八碳三烯酸(亞麻酸) 有4個α碳原子，結果氧化反應將受C11和C14的支配。熱、金屬催化劑、紫外線和可見光可以加速脂肪酸或甘油酯自由基形成，從脂肪酸或甘油酯中脫氫所需的能量取決于分子中氫的位置。

表1 脂肪酸自動氧化形成的氫過氧化物[47]

3.3 不飽和脂肪酸熱致異構化理論機制量子化學計算

眾多研究表明，不飽和脂肪酸甘油三酯經產生自由基(α-自由基)而使雙鍵發生cis/trans異構化，主要包含直接異構化和質子轉移異構化2種反應機理[30,36,48]。Li等[21]利用量子化學密度泛函理論(DFT)對油酸(C18∶1)經質子轉移途徑的cis/trans異構化反應機制的理論推理和試驗結果表明，順式油酸在145.46 ℃下發生了焓變(放熱現象)，順式和反式油酸基態能量差為7.6 kJ/mol，其值低于順式和反式亞油酸(C18∶2)能量差(13.2 kJ/mol)。油酸發生順/反異構化的過渡態能壘為294.5 kJ/mol，其值大于亞油酸(284.2 kJ/mol或286.4 kJ/mol)[21]。李安[5]對油酸順反異構化反應理論的研究表明，油酸異構化按照直接異構化反應理論包含1種過渡態和1條途徑。Cheng等[34]對油酸順/反異構化反應理論計算和實驗證明，油酸順/反異構化反應需要氧氣參與并可能開始于150 ℃，從油酸角度闡明了不飽和脂肪酸發生氧化反應形成自由基經過β均裂(ROOH均裂的活化能為160.97 kJ/mol)產生TFAs的理論機制。Tsuzuki[22]的研究也證實了這一理論機制。按照直接異構化反應理論，順式亞油酸需克服236.9 kJ/mol以上的能壘形成雙自由基渡態，且反式雙鍵越多，所需克服的能壘數量越多；反應溫度越高，速率常數越大。而按照質子轉移異構化理論，單一反應途徑需克服286.4 kJ/mol的能壘，過渡態中間產物為一個包含3個碳原子和4個氫原子的π34離域體系[5]。根據質子轉移異構化機理，亞麻酸分子中的氫原子向相鄰的碳原子轉移形成過渡態產物，單獨的反應途徑需要達到 290.4 kJ/mol 的能量，包含有3個過渡態和1個中間體，過渡態的中間產物體系為一個具有4個氫原子和3個碳原子的大離域體系[5,16]。

4 熱致異構化反應途徑與動力學

4.1 熱致異構化反應途徑和模式

不飽和甘油三酯的雙鍵在高溫氧化反應過程中會發生斷裂所生成烯丙基自由基有可能成為TFAs形成的底物。理論上，不飽和脂肪酸在加熱條件下，隨著熱致異構化反應的發生，會按順序先生成單式異構體，再生成雙反式異構體，最后生成三反式的異構體，形成一定分布情況的順反異構化產物(反式油酸、反式亞油酸、反式亞麻酸)[16,17]。李安[5]研究表明，順式油酸分子的碳碳雙鍵經一種過渡態、一條途徑進行了非遷移的順反異構化形成了反式油酸；亞油酸熱致異構化按照直接異構化反應理論包含4個過渡態和2條途徑。亞麻酸熱致異構化反應根據直接異構化的反應機理，亞麻酸異構化反應需要包含6條途徑和12種過渡態[5,16]。賀凡[17]研究證實，亞油酸熱致異構首先形成單反式 C18∶2-9c12t和 C18∶2-9t12c異構體，再形成雙反式 C18∶2-9t12t異構體。姜帆[16]實驗表明，α-亞麻酸甘油三酯熱致異構途徑是：先形成C18∶3-9t, 12c, 15c、C18∶3-9c, 12t, 15c、C18∶3-9c, 12c, 15t單反式異構體，再形成C18∶3-9c, 12t, 15t、C18∶3-9t, 12c, 15t、C18∶3-9t, 12t, 15c雙反式異構體，最后形成C18∶3-9t, 12t, 15t三反式異構體。通過以上研究初步闡明了不飽和甘油三酯熱致異構化的反應途徑和模式。

4.2 熱致異構化反應動力學

圖4 不飽和脂肪酸順反異構化反應能量途徑(油酸)

5 抗氧化劑抑制TFAs形成作用

不飽和脂肪酸熱致異構化反應由溫度主導，不飽和脂肪酸雙鍵在常溫下相對穩定而很難發生順/反異構化，而在足夠高溫度下則相對容易[56]。不飽和脂肪酸在 160～220 ℃條件下產生TFAs的含量隨加熱溫度升高和加熱時間延長而逐漸增加[17,19]。理論上，調控加熱溫度和縮短加熱時間是降低 TFAs 含量最簡單直接而又最有效的方法，以往有關抑制TFAs的方法主要集中在其形成抑制方面，尤其是在熱加工過程中如何采取各種措施以降低食品中TFAs的含量，如原料的改良、添加劑的使用、優化加工工藝、改進加工方法和設備等方面。但實際加工過程中當溫度過低或處理時間不夠會降低食品的感官品質(色澤、風味、質地和口感等)和安全性[17]。通過分析發現，不飽和脂肪酸(油酸、亞油酸和亞麻酸)熱致異構化反應屬于自由基反應，其中無論是自由基反應(自由基催化順式/反式異構化、雙自由基扭轉)、直接異構化還是質子轉移異構化，其過渡態均包含自由基或者類似自由基的結構。因而，在不改變加熱溫度和加熱時間的前提下，目前普遍認為延緩和預防油脂的氧化酸敗工作量最低、最有效和最常見的方法是在油脂中添加抗氧化劑，以消除痕量自由基，阻止鏈式反應的進行，進而防止油脂氧化和TFAs產生。

Elisia等[58]研究認為抗氧化劑中的羥基通過提供氫原子與酯自由基結合形成更穩定的產物，從而阻止酯自由基鏈的持續氧化，實現降低甘油三酯熱致異構過程形成的過量酯自由基，從而中斷或抑制自由基引起的油脂自動氧化反應。因而添加自由基清除劑可抑制熱致異構化反應產TFAs[18]，而且抗氧化劑清除自由基能力越強，對TFAs 的抑制程度也越大[31]。目前普遍認為延緩和預防油脂的氧化酸敗工作量最低、最有效和最常見的方法是在油脂中添加抗氧化劑，以消除痕量自由基，阻止鏈式反應的進行，進而防止油脂氧化和TFAs產生。傳統的人工合成抗氧化劑丁基羥基茴香醚(Butyl hydroxy anisol, BHA)、2, 6-二叔丁基-4-甲基苯酚 (Butylated hydroxytoluene, BHT)、特丁基對苯二酚(Tertiary butyllhydroquinone, TBHQ)和沒食子酸丙酯(Propyl gallate, PG)均在食用油中具有較好的抗氧化和抗異構化效果[19,26,27,30,31]。但這些人工合成抗氧化劑具有潛在毒性甚至致癌，許多國家已禁止使用[60]。因此，從植物資源中尋找安全高效和熱穩定性好的天然TFAs抑制劑是目前重要的發展方向和研究重點。近年來，維生素E(VE)、迷迭香提取物、茶多酚、芝麻酚、葉黃素、鼠尾草酸、茶多酚、谷維素和兒茶素等天然抗氧化劑均可有效抑制TFAs的形成[17,19,30,61]。然而有報道稱，維生素E、茶多酚和谷維素等多數天然抗氧化劑在高溫加熱條件下對TFAs形成的抑制作用效果并不理想，有些甚至還會對熱致異構產物具有誘導作用[5,17]。如茶多酚低于160 ℃穩定性較好，隨著溫度的升高，其穩定性顯著下降[62]；茶多酚、VE、VC、BHT和BHA 等常用抗氧化劑在約200 ℃高溫條件下的抗氧化效果明顯下降，而CA還能發揮穩定的抗氧化性能[63]。TBHQ、茶多酚、阿魏酸乙酯和谷維素在高溫240 ℃加熱條件下對熱致異構產物具有誘導作用[17]。賀凡[17]的研究結果顯示鼠尾草酸對TFAs(C18∶2-9c12t、C18∶2-9t12c和tt-CLAs)的形成具有顯著抑制作用但不影響CLAs的生成，可作為油脂熱致異構化調控的選擇[17]。究其因，可能是因為多數天然抗氧化劑熱穩定性較差，在食用油熱加工過程初期就發生了氧化降解，很難在食用油熱致異構化反應中清除活性羰基類化合物、活性氧族和脂質自由基，阻斷TFAs的生成途徑。

6 結束語

由于熱致異構化通常在較高溫度(150 ℃及以上)下發生，并非具有抗氧化作用的天然活性物質一定具有抗異構化作用。若要有效控制熱致異構化反應，天然TFAs抑制劑必須具備耐高溫、清除自由基活性強和對食品品質影響小等特點。賀凡[17]研究結果表明，抗氧化劑對熱致異構化反應抑制作用與抗氧化活性成分的羥基氫、熱穩定性、結構和不飽和脂肪酸甘油三酯結構及雙鍵的含量有關[17]。

目前鮮見關于利用密度泛函理論研究抗氧化劑抑制不飽和脂肪酸異構化反應機理的報道，有關密度泛函理論對鼠尾草酸、茶多酚、酚羧酸、維生素 E及合成抗氧化劑 BHA、BHT等典型的天然和合成酚類抗氧化劑以及黃酮類化合物清除自由基機理和不飽和脂肪酸異構化機理的研究較多[5,38,42,46,65]，這些報道和研究為利用抗氧化劑抑制TFAs的形成提供了思路和借鑒。今后可以考慮從天然活性成分中尋找耐高溫、清除自由基活性強和對食品品質影響小的抗氧化劑，在此基礎上，進一步考慮從動力學和能量角度出發，結合密度泛函理論研究抗氧化劑抑制TFAS形成機制。此外，油脂熱降解、熱聚合和熱環氧化等反應所產生油脂危害物質(3-氯丙醇酯、縮水甘油酯、丙烯酰胺、極性物質、苯并芘、呋喃和2-烷基呋喃等)物質直接或間接與油脂熱氧化反應相關，可以考慮加強對抗氧化劑抑制這些油脂熱加工過程產物形成作用研究，以便為油脂熱加工過程產物調控機制研究提供參考。