4種微生物制劑對凡納濱對蝦育苗水質及仔蝦存活的影響

洪居懇，薛 明，寧為民，李成聰，陳 耀，余文智，黃雪敏，梁華芳，溫崇慶

( 廣東海洋大學 水產學院，廣東 湛江 524088 )

凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)肉質鮮美、產量高，是我國對蝦養殖主要的物種之一。優質苗種是對蝦產業可持續發展的基礎。對蝦育苗環境相對封閉，育苗期間幼體頻繁變態，體質脆弱，代謝物、殘骸及殘餌積累，易造成水質惡化和病原滋生，導致幼體患病甚至大量死亡[1-3]。用抗生素等化學藥物防控對蝦育苗期病害有諸多負面影響，因而逐漸少用甚至禁用。近20年來，利用有益微生物或益生菌替代化學藥物進行對蝦微生態育苗研究日益增多，商品化微生物制劑或益生菌制劑在對蝦育苗上也得到廣泛應用[4-6]。

水產微生物制劑主要有芽孢桿菌(Bacillus)、乳酸菌、酵母菌和光合細菌等，還包括不同菌種組合成的復合型制劑[5-7]。目前，已有用商品化微生物制劑改善對蝦養殖水質的報道[5-6]，但多為仔蝦或幼蝦養成試驗，涉及對蝦幼體培育期水質影響的研究相對較少，作用效果上也有所差異。如劉建勇[8]利用復合微生物制劑進行凡納濱對蝦育苗試驗，育苗期間處理組溶解氧、氨氮和化學需氧量等水質指標均明顯優于對照組；而Silva等[9]開展的復合芽孢桿菌制劑培育凡納濱對蝦幼體試驗結果顯示，處理組與對照組水體溶解氧、氨氮和亞硝態氮含量等指標均無顯著差異。筆者在檢測4種微生物制劑菌種的基礎上，在凡納濱對蝦育苗期間連續投放4種微生物制劑，研究其對水質和仔蝦存活的影響，為微生物制劑在對蝦育苗中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 微生物制劑

兩種芽孢桿菌制劑，分別標注為地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)和枯草芽孢桿菌(B.subtilis)；兩種乳酸菌制劑，分別標注為糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)和植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)。均為廣東某公司生產的高密度純菌粉(1 kg/包)，其標注的菌種組成和菌密度見表1。

1.2 菌含量檢測

采用稀釋涂布平板法測定活菌含量，分別稱取各制劑5 g于生理鹽水中制成50 mL懸液，再用生理鹽水進行10倍梯度稀釋，取不同梯度稀釋液100 μL涂布平板。其中，芽孢桿菌制劑涂布營養肉湯(北京陸橋，CM106)瓊脂培養基，乳酸菌制劑同時涂布營養肉湯和MRS瓊脂培養基[10]。每一梯度3塊平板，30 ℃下培養5 d，每日觀察記錄菌落數。每種制劑重復檢測2次，取測定平均值作為最終計數結果。

表1 微生物制劑菌密度

注：*和**分別表示營養肉湯瓊脂和MRS瓊脂計數結果.

Note: * and ** represent the counting results from nutritional broth agar and MRS agar, respectively.

1.3 菌種鑒定

從每種制劑計數平板上各選取2～3個代表性單菌落，進一步純化后保存備用。參考文獻[2]方法提取代表菌株基因組DNA，再以細菌16S rRNA基因引物(27F和1492R)PCR擴增基因組DNA。將擴增產物委托華大基因廣州分公司通過ABI 3730XL測序儀以27F和1492R引物雙向測序。將測得序列拼接完整后，提交EzBioCloud數據庫(https://www.ezbiocloud.net/)，與模式菌株的16S rRNA基因序列比對分析，以確定其可能種屬信息。調取代表菌株及其最相似5株模式菌株16S rDNA序列，連同制劑標注菌種的模式菌株序列，通過MEGA 7軟件以鄰接法構建系統進化樹。

1.4 育苗試驗

育苗試驗在湛江東海島廣東海洋大學養殖基地進行，采用300 L玻璃鋼桶，每桶加入250 L來自同一蓄水池并經過濾的海水，放幼體前用體積分數20×10-6的甲醛消毒1 d，再曝氣處理1 d。試驗用凡納濱對蝦幼體取自廣東徐聞某對蝦種苗場，每桶放入無特定病原的無節3期幼體5×104尾。試驗設4個制劑處理組和對照組，每組設3個平行。除對照組始終不投菌劑外，各處理組由溞狀Ⅰ初期至仔蝦Ⅰ期，每日分別投制劑1次。綜合參考以往芽孢桿菌和乳酸菌在對蝦育苗試驗中的投菌量[4,9,11-18]，地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌組投菌每次5×108cfu/L，糞腸球菌和植物乳桿菌組投菌每次1×108cfu/L，連續投菌10 d，常規投喂和飼養管理。投菌前各制劑加少量無菌海水于30 ℃下活化，芽孢桿菌制劑活化6 h，乳酸菌制劑活化3 h。試驗期間不換水，不用藥，連續充氣。育苗水溫29.6～33.3 ℃，鹽度26.5～30.0，pH 8.01～8.20，溶解氧7.82～8.05 mg/L。所有試驗桶飼喂管理相同，由溞狀Ⅰ期開始每隔4 h、每日6次投喂螺旋藻粉和蝦片，糠蝦Ⅰ期開始加喂冰凍鹵蟲(Artemia)，仔蝦期僅投喂蝦片和鹵蟲。

育苗水溫、鹽度、pH和溶解氧分別用便攜式溫度計、鹽度計、pH計和溶氧儀日常監測。幼體發育到溞狀Ⅰ～Ⅱ、糠蝦Ⅰ～Ⅱ和仔蝦Ⅰ期時，通過300目濾網隔離幼體采集水樣，參考《海洋監測規范》方法[19]，水樣先經過0.45 μm濾膜抽濾，再分別采用靛酚藍、鹽酸萘乙二胺和磷鉬藍分光光度法測定水體氨氮、亞硝態氮和無機磷含量；化學需氧量則直接以現場采集的水樣通過堿性高錳酸鉀法進行測定。

參考文獻[20]的方法，觀察幼體和仔蝦生長存活情況，并統計各組仔蝦Ⅰ期和仔蝦Ⅲ期存活率。

1.5 數據處理

數據以平均值±標準差表示，在統計分析組間仔蝦存活率差異時先進行反正弦平方根轉換，再采用SPSS 17.0 軟件進行單因素方差分析，若差異達顯著水平，則以Duncan′s多重比較分析不同處理間的顯著性，顯著性水平α=0.05。

2 結 果

2.1 微生物制劑活菌密度

4種制劑活菌密度均≥1.30×1010cfu/g，除地衣芽孢桿菌制劑檢測值略低于其標注密度外，其余3種制劑菌密度均不低于標注值。兩種乳酸菌制劑在MRS和營養肉湯瓊脂平板上計數結果基本一致，以MRS瓊脂計數為準(表1)。

2.2 菌種鑒定

4種制劑計數平板上均只有一種類型細菌菌落，幾無雜菌。從同一制劑分離純化菌株的菌落特征完全一致，從地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、糞腸球菌和植物乳桿菌制劑分離菌株中各選1株作為代表菌，編號分別為DY1、KC1、FC1和ZW1。4株代表菌16S rRNA基因序列在GenBank登錄號為MK441691～MK441694。通過EzBioCloud數據庫，4株代表菌與模式菌16S rRNA基因序列比對結果見表2。各株代表菌與其最相近5株模式菌序列相似性均超過或接近99%。其中ZW1與植物乳桿菌植物亞種(L.plantarumplantarum)模式菌株序列完全一致。與KC1最相似的3種菌分別為暹羅芽孢桿菌(B.siamensis)、貝萊斯芽孢桿菌(B.velezensis)和枯草芽孢桿菌枯草亞種(B.subtilissubtilis)，與其模式菌株分別有4、4、6個堿基差異，KC1可能屬于其中某一種。DY1與KC1序列有2個堿基差異，與兩者最相似的5株模式菌株也一致，僅相似性略有差異。DY1與暹羅芽孢桿菌和貝萊斯芽孢桿菌模式菌株序列有2個堿基差異，與另外3種模式菌株也有6個堿基差異，屬于其中一種芽孢桿菌，但DY1與地衣芽孢桿菌模式菌株序列差異達28個堿基，相似性98.02%，排除地衣芽孢桿菌的可能。與FC1最相似的兩種菌分別是乳酸腸球菌(E.lactis)和屎腸球菌(E.faecium)，與其模式菌株分別有5個和6個堿基不同，很可能屬于其中一種，但FC1與糞腸球菌模式菌株序列有58個堿基差異，相似性不到96%，因而非糞腸球菌(E.faecalis)。可見植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌制劑標注菌種與鑒定結果一致或基本一致，而地衣芽孢桿菌與糞腸球菌制劑標注菌種雖屬名無誤，但種名與實際鑒定結果不符。

系統進化樹(圖1)顯示，菌株KC1和ZW1分別與包含相應標注菌種在內的最相似幾菌株緊密聚為一類，但DY1與其標注菌種地衣芽孢桿菌明顯分開，而與KC1等聚為一類。同樣，FC1與其標注菌種糞腸球菌也明顯分開，而與乳酸腸球菌和屎腸球菌等聚為一類。進一步表明地衣芽孢桿菌和糞腸球菌制劑的標注菌種與實際不符，而植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌制劑的菌種標注與實際相符。

表2 分離代表菌株與模式菌株16S rRNA基因序列相似性

圖1 微生物制劑分離菌株16S rRNA基因系統進化樹

2.3 投放微生物制劑對育苗水質影響

同一階段各組水溫、鹽度、pH和溶解氧均無顯著差異。水體氨氮含量隨育苗時間延長明顯升高，溞狀Ⅰ～Ⅱ期和糠蝦Ⅰ～Ⅱ期，地衣芽孢桿菌組氨氮含量顯著高于其他4組(P<0.05)，其他組間差異均不顯著(P>0.05)。仔蝦Ⅰ期，地衣芽孢桿菌組氨氮含量顯著高于除植物乳桿菌組外的其他組(P<0.05)；枯草芽孢桿菌組氨氮含量最低，并顯著低于地衣芽孢桿菌和植物乳桿菌組(P<0.05)，但枯草芽孢桿菌、糞腸球菌及對照組間均無顯著差異(P>0.05)(圖2)。

亞硝態氮含量在3個階段均相對穩定，并維持在較低水平(圖3)，除溞狀Ⅰ～Ⅱ期糞腸球菌和植物乳桿菌組亞硝態氮含量顯著低于對照組外，各組間差異均不顯著(P>0.05)。

與氨氮含量變化趨勢相似，無機磷含量也隨幼體發育明顯升高(圖4)，3個階段地衣芽孢桿菌組無機磷含量均顯著高于其他4個組(P<0.05)，而其他組間差異均不顯著(P>0.05)。

各組化學需氧量從溞狀Ⅰ～Ⅱ期到糠蝦Ⅰ～Ⅱ期顯著升高，其后到仔蝦Ⅰ期略有升高(圖5)。溞狀Ⅰ～Ⅱ期，枯草芽孢桿菌組與地衣芽孢桿菌組差異不顯著(P>0.05)，但均顯著高于其他3組；糠蝦Ⅰ～Ⅱ期及仔蝦Ⅰ期，地衣芽孢桿菌組化學需氧量顯著高于其他4組(P<0.05)。其他4組中，除枯草芽孢桿菌組化學需氧量在溞狀Ⅰ～Ⅱ期和仔蝦Ⅰ期顯著高于對照組外，各組間差異均不顯著(P>0.05)。

圖2 4種微生物制劑對育苗水體氨氮含量影響

圖3 4種微生物制劑對育苗水體亞硝態氮含量影響

圖4 4種微生物制劑對育苗水體無機磷含量影響

圖5 4種微生物制劑對育苗水體化學需氧量影響

綜上，育苗水體連續投放4種制劑后，地衣芽孢桿菌組氨氮、無機磷和化學需氧量顯著增加，對水質表現為負面影響。其他3種制劑組，除枯草芽孢桿菌組化學需氧量在溞狀Ⅰ～Ⅱ期和仔蝦Ⅰ期顯著增加，糞腸球菌和植物乳桿菌組在育苗早期亞硝態氮含量顯著降低外，對育苗期所測水質指標均無顯著影響。

2.4 對蝦生長和存活情況

試驗期間，枯草芽孢桿菌組幼體活力相對最佳，趨光性強，個體較大，糞腸球菌和植物乳桿菌組和對照組次之，而地衣芽孢桿菌組最差。由圖6可見，枯草芽孢桿菌組仔蝦存活率最高，但仔蝦Ⅰ期各組間均無顯著差異(P>0.05)；仔蝦Ⅲ期枯草芽孢桿菌組存活率顯著高于地衣芽孢桿菌組(P<0.05)，但與其他各組間差異仍不顯著(P>0.05)。

圖6 4種微生物制劑對仔蝦存活率影響

3 討 論

3.1 水產微生物制劑質量

隨著水產養殖業迅猛發展，抗生素等化學藥物濫用對養殖環境引發的負面問題日趨嚴重，水產益生菌或微生物制劑由于安全環保、成本低、使用簡便等諸多優點而備受重視[6]，市場需求日益旺盛。但由于水產微生物制劑產品生產和市場準入門檻低，又缺乏有效監管，因而魚龍混雜，一些產品名不副實，給養殖生產造成不必要的損失[7]。如溫崇慶等[7]對9種芽孢桿菌制劑檢測發現，大多數制劑菌密度低于甚至遠低于其標注密度，有些產品標注菌種與實際鑒定結果不符。

本研究檢測的4種微生物制劑菌種單一，含菌量與其標注密度基本一致，或高于標注密度。16S rRNA基因測序分析表明，植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌制劑菌種與其標注菌種相符；雖然地衣芽孢桿菌制劑菌種也屬于芽孢桿菌，但非地衣芽孢桿菌；糞腸球菌制劑分離菌雖為腸球菌屬菌種，但不是糞腸球菌，可能是乳酸腸球菌或屎腸球菌。糞腸球菌和屎腸球菌為不同種，無論是中文名還是拉丁種名均易混淆，常被誤認為同一種菌。需強調的是，16S rDNA序列通常難以在種水平上準確鑒定細菌，但可簡便有效甄別被鑒定菌株屬于哪幾種菌，或排除是某種菌的可能性。種水平鑒定還需結合生理生化等特征或借助其他基因特征。微生物制劑含菌量及菌種是其發揮作用的關鍵，對于商品化微生物制劑，條件許可時使用前應予以檢測，以明確其有效含菌量和菌種組成。

地衣芽孢桿菌和糞腸球菌制劑標注菌種與實際不符，地衣芽孢桿菌制劑最可能菌種為暹羅芽孢桿菌或貝萊斯芽孢桿菌(表2)，有報道顯示，這兩種菌均可抑制水產病原菌并可作為益生菌[21-24]；糞腸球菌制劑最可能菌種——屎腸球菌或乳酸腸球菌在畜禽養殖上常用作益生菌，腸球菌也用作水產益生菌[5-6]，然而在對蝦育苗中罕見這幾種菌的報道，因此本試驗也將這兩種制劑用于育苗試驗，評估其實際應用效果。

3.2 芽孢桿菌和乳酸菌對對蝦育苗水質影響

芽孢桿菌具有多種胞外酶，可將對蝦養殖環境中的有機物迅速分解而凈化水質[5-6]，被廣泛用于水產養殖，但其對凡納濱對蝦或斑節對蝦(Penaeusmonodon)幼體培育水質的影響效果不一。Nimrat等[15]報道，復合型芽孢桿菌制劑可顯著降低對蝦育苗水體的氨氮和亞硝態氮含量，但多數研究均顯示，包括枯草芽孢桿菌在內的單一芽孢桿菌益生菌對對蝦育苗水質影響不明顯[9,12-14,16,25]。暹羅芽孢桿菌或貝萊斯芽孢桿菌可抑制水產病原菌，提高水產動物生長或免疫力[21-24]，但其對對蝦育苗水質及幼體生長影響鮮見報道。本試驗中，兩種芽孢桿菌制劑與對照組相比，地衣芽孢桿菌組除對亞硝態氮含量無顯著影響外，在不同階段均顯著增加了水體氨氮、無機磷含量和化學需氧量，對水質表現一定負面影響，但所測水質指標均在安全范圍內。與對照組相比，枯草芽孢桿菌組除增加或顯著增加育苗化學需氧量外，對其他水質指標始終無顯著影響。枯草芽孢桿菌組化學需氧量的顯著上升，可能與連續投菌顯著增加了水體中芽孢桿菌的密度，即與有機物含量增加有關，也可能是因為大量芽孢桿菌進入幼體腸道后促進了幼體消化和排泄，造成化學需氧量升高。兩種芽孢桿菌制劑在育苗和投菌方式相同情況下，對水體氨氮和無機磷含量影響差異顯著，可能與兩種制劑的菌種或菌株不同有關，另一方面，不同制劑發酵后菌體以外的其他成分也可能存在明顯差異，進而對水質和養殖動物造成不同影響[7,16]。

乳酸菌種類繁多，用作水產益生菌的主要有乳酸桿菌、腸球菌和乳球菌(Lactococcus)等[5-6]。乳酸菌可有效去除養殖水體中亞硝態氮[26-29]、磷酸鹽[27]和氨氮[28-30]，也有報道乳酸菌可增加氨氮含量[27]。本試驗兩種乳酸菌制劑僅在育苗早期顯著降低水體亞硝態氮含量，一定程度上改善了水質，與以往報道乳酸菌可消減水體亞硝態氮含量[26-27]一致，但兩種制劑對水體氨氮、無機磷含量和密度始終無顯著影響。可能原因是不同菌種或菌株的代謝有所差異，以及應用環境不同，如本試驗中兩個乳酸菌處理組與對照組所測水質指標始終在安全范圍內，水質上無明顯脅迫壓力。本試驗與已有的相關研究均表明，試驗環境、菌種和制劑差異等均可能影響微生物制劑對水質的作用效果。

3.3 芽孢桿菌和乳酸菌對幼體和仔蝦生長的影響

除改善水質外，益生菌還能提高養殖動物生長和存活，其機制主要包括抑制病原、補充營養、促進消化和提高免疫等[5-6]，但不同菌種甚至同種不同菌株的作用方式各有側重，效果也有所差異。大多數研究顯示，在對蝦育苗體系中連續投入較高密度芽孢桿菌可顯著提高幼體或仔蝦存活率[4-5,9,11-17,31]，促進生長或變態[5,9,11-12,14-15,17]，增強蝦苗抗逆性[14,17]。但一些研究也顯示，進一步提高用菌量作用效果不再提升[12-13,15-17,31]，甚至可能造成幼體存活率下降[16]。乳酸菌對對蝦生長影響的研究多集中于幼蝦或成蝦試驗[5-6,32-33]，對幼體影響報道較少。姜松等[17]研究顯示，每隔一定時間投放較高密度乳酸菌制劑，可顯著提高凡納濱對蝦仔蝦存活率和抗逆性；劉建勇等[8,18,31,34]研究顯示，含有乳酸菌的復合菌劑可顯著提高幼體和(或)仔蝦存活率，但這些報道中乳酸菌菌種大多未明確，且復合菌劑包含多種類型微生物，難以界定乳酸菌的作用。

本試驗中，兩種芽孢桿菌制劑對幼體和仔蝦影響差異明顯。所有試驗組中，枯草芽孢桿菌組應用效果最佳，幼體和仔蝦不僅存活率高且活力強，而地衣芽孢桿菌組不僅幼體活力最差，仔蝦Ⅲ期存活率還顯著低于枯草芽孢桿菌組，這可能與地衣芽孢桿菌組水體氨氮和無機磷含量顯著升高有一定關系。兩種乳酸菌制劑處理組與對照組相比，幼體活力及仔蝦存活率均無明顯差異。參考以往對蝦幼體培育試驗中芽孢桿菌投菌量及其作用效果[4,9,11-18]，4種制劑均以連續方式投菌，投菌量適宜，但4個處理組與對照組間仔蝦存活率相比均無顯著差異。Guo等[12]在斑節對蝦育苗期間每日投放紡錘芽孢桿菌(B.fusiformis)，處理組與對照組仔蝦Ⅰ期存活率也無顯著差異，但該菌應用于凡納濱對蝦育苗時，處理組存活率和變態速度均顯著提高；Nimrat等[15]自凡納濱對蝦溞狀Ⅲ期幼體開始連續投用復合芽孢桿菌益生菌，4 d后6個處理組幼體存活率和生長均無顯著提高，但將其用于仔蝦時，所有處理組存活率和生長均顯著高于對照組。可見，益生菌的作用對象和環境對幼體的生長和存活具有重要影響。芽孢桿菌和乳酸菌作為水產益生菌均可通過拮抗病原、增強免疫、促進消化和調節腸道菌群等方式發揮作用，芽孢桿菌通常還具有降解有機物作用。本研究育苗試驗期間幼體無明顯病原感染，育苗水質良好，幼體營養也較充分，因此在無明顯脅迫條件下，與對照組相比4種制劑的作用效果難以通過存活率顯著體現，但其中的兩種芽孢桿菌制劑可能因菌種或制劑成分差異，作用效果明顯不同。