銅、鋅對泥鰍細胞DNA損傷及金屬硫蛋白表達的影響

姜 姍，李 霞，李狀狀，楊艷津，王 鈺，朱元辰，秦艷杰

( 大連海洋大學，遼寧省海洋生物資源恢復與生境修復重點實驗室，農業農村部北方海水增養殖重點實驗室，遼寧 大連 116023 )

生物標志物監測是現代毒理學效應評估的主要手段，可以有效地評估重金屬暴露對生物體的毒性效應和對生態環境的健康風險。理想的生物標志物要求能夠敏感有效地反映出生物體發生嚴重損傷之前的生物學指標變化，并能準確評估生物體所處的污染狀態及其潛在危害，為嚴重毒性效應的出現提供早期警報[1]。體外培養的魚類細胞可以直接和污染物接觸，具有靈敏度高、均一性好、觀察方便等特點，是毒理學研究中理想的生物標志物。早在1968年研究者首次利用體外培養的魚類肌肉細胞系檢測環境中鋅的毒性作用，得出細胞存活率與鋅離子濃度之間呈正相關的毒性效應[2]。之后的系列毒性效應研究結果表明，重金屬因種類、狀態、細胞系類別和代數不同，其毒性效應差別明顯[3-7]，鋅和銅兩種重金屬對大多數細胞系表現為中度毒性，但毒性效應并沒有一定的規律性。

生物體內DNA、RNA等遺傳物質受內外因素影響會發生斷裂、缺失等損傷，從而引起系列的遺傳損傷。遺傳損傷常用的檢測方法包括DNA電泳、彗星試驗、微核等。研究發現，草魚(Ctenopharyngodonidellus) ZC7901細胞[8]，野生細鱗(Theraponjarbua)鰭細胞系(JF細胞)，羅非魚(Oreochromis)卵巢細胞系(TO-2細胞)[9]，烏鱧(Channaargus)肝細胞[10]，金頭鯛(Sparusaurata)SAF-1細胞系[11]，泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)DIMF、TRMF細胞系[12-13]等在不同重金屬誘導下均出現不同程度的DNA特異降解、斷裂和損傷，從而導致細胞凋亡。細胞損傷程度和凋亡比例與重金屬種類、重金屬濃度及細胞種類有關。金屬硫蛋白是細胞內與重金屬結合相關的特異性蛋白質，其生理功能主要包括調節細胞內金屬離子含量、抗氧化作用、參與細胞調節、免疫調節等。另外，由于金屬硫蛋白能夠響應重金屬脅迫，并在一定范圍內反映重金屬污染及其毒性效應的程度，早在20世紀70年代就有學者指出，水生動物金屬硫蛋白可以作為指示水環境重金屬污染物毒性效應早期預警的重要生物標志物，用以評價重金屬污染物的毒性，指示重金屬對生物體和環境的污染程度[14]。

筆者以實驗室此前建立的泥鰍鰭細胞系為試驗材料，探究硫酸銅和氯化鋅對泥鰍鰭細胞系的遺傳學損傷及金屬硫蛋白基因表達的影響，旨在探究必需重金屬對泥鰍細胞的遺傳毒性，為研究重金屬的生理學功能及重金屬環境監測提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用60～70代泥鰍鰭細胞系(DIMF)是大連海洋大學細胞工程實驗室于2012年建立的。細胞系培養采用含15%胎牛血清(FBS，Omega)的DME/F12培養基于25 ℃、5% CO2的恒溫培養箱中培養。

1.2 試驗方法

1.2.1 細胞系染毒處理

取處于對數生長期、生長狀態良好的鰭細胞系，用0.25%的胰蛋白酶消化處理貼壁細胞成懸浮細胞，用血球計數板計算出細胞密度并調整到密度為2×105個/mL，每孔以200 μL的量接種到96孔板上，或者以5 mL的細胞量接種到25 mL細胞培養瓶中。在恒溫培養箱(5% CO2，25 ℃)中培養24 h后，棄去舊細胞培養液，加入相同體積、添加濃度為0、200、400、800、1600 μmol/L氯化鋅的新細胞培養液；另一個試驗添加濃度為0、100、200、400、800 μmol/L硫酸銅的細胞培養液，每個濃度設3個平行組，然后放置于25 ℃、5% CO2恒溫培養箱繼續培養24 h。

1.2.2 單細胞凝膠電泳試驗(彗星試驗)

單細胞凝膠電泳試驗參照文獻[15]的方法進行，并略有改動。取預熱的磨砂載玻片浸入45 ℃、0.7%的正常熔點瓊脂糖中，迅速加蓋玻片使膠鋪平，放置于4 ℃固化過夜，制成第一層膠。取下蓋玻片，將各濃度分別染毒的細胞處理成懸液，以1∶7的比例與37 ℃、0.8%瓊脂糖(0.08 g低熔點瓊脂糖溶于7 mL TAE緩沖液中)混合，取混合液100 μL加到第一層膠上，蓋上蓋玻片，4 ℃固化10 min。固化好的載玻片在冰冷的堿性裂解液中低溫避光裂解1 h。從裂解液中取出載玻片，用蒸餾水將其沖洗3次，然后放置于電泳液(0.186 g Na2EDTA和6 g NaOH溶于500 mL去離子水中，pH調整為13.0)中，低溫避光解旋30 min。設置電壓為25 V，電流為200 mA，調整電泳液液面使電流保持為200 mA，低溫避光電泳30 min。電泳結束后，取出載玻片，用蒸餾水清洗3次，保存于潮濕的片盒中，觀察時每片滴加25 μL 20 μg/L的溴化乙啶，蓋上蓋玻片即可進行觀察。

在波長為460 nm時用200倍熒光顯微鏡觀察并拍照。用彗星分析軟件(CASP)處理分析彗星試驗結果圖，每個濃度處理分析200個細胞，測量拖尾率、彗星尾長、彗尾DNA比例、彗星尾距和Olive尾矩5項數據。

1.2.3 金屬硫蛋白表達量的測定

將不同濃度氯化鋅和硫酸銅染毒的細胞用胰蛋白酶處理成懸浮細胞，放置離心管中以4000 r/min離心3 min，用1 mL磷酸緩沖鹽溶液重懸，按照總RNA提取試劑盒(TaKaRa)的方法提取細胞總RNA，并用水平電泳儀和核酸分析儀檢測RNA完整性、含量和純度。根據測定結果將RNA質量濃度調整為500 ng/μL。按照全式金反轉錄試劑盒，以20 μL RNA反轉錄體系反轉錄成cDNA第一條鏈，-20 ℃保存備用。以泥鰍β-Actin基因(AB200265)作為內參基因，根據參考文獻[16]設計金屬硫蛋白擴增引物。按照全式金實時熒光定量試劑盒步驟，以20 μL體系進行實時定量PCR，同時設置陰性對照組。試驗結果以2-ΔΔCt法處理：

ΔΔCt=(樣品Ct-內參Ct)-(對照Ct-內參Ct)

1.3 數據處理

試驗結果以平均值±標準差表示，比較分析采用SPSS 16.0軟件檢驗試驗組與對照組之間的差異顯著性，P<0.05表示存在顯著差異。

2 結 果

2.1 硫酸銅對泥鰍鰭細胞系DNA損傷的影響

顯微觀察和對應的CASP彗星軟件處理結果見圖1。倒置熒光顯微鏡觀察發現，正常未處理的細胞經裂解液裂解并電泳后，移動距離較短，且細胞多以圓形存在，邊界較清晰(圖1a)；硫酸銅濃度為100 μmol/L時，細胞也接近圓形，但邊緣有所擴大且模糊不清(圖1b)；硫酸銅濃度為200 μmol/L細胞邊緣進一步擴大，且出現拖尾情況，尾部輪廓寬大呈放射狀(圖1c)；當硫酸銅濃度為400、800 μmol/L時，多數細胞出現明顯的拖尾情況，尾部范圍逐漸擴大，且逐漸清晰拉長(圖1d～e)。總體來看，隨著硫酸銅濃度的升高，其彗星尾部范圍逐漸增大。軟件分析中各彗星圖片的數量指標(表1)表明，當硫酸銅濃度為100 μmol/L時，僅拖尾率與對照組出現顯著差異(P<0.05)，其他4個指標均與對照組差異不顯著(P>0.05)。當硫酸銅濃度為200、400 μmol/L和800 μmol/L時，5個數量指標均顯著高于對照組(P<0.05)。

圖1 硫酸銅處理后泥鰍鰭細胞系的彗星試驗結果

表1 硫酸銅處理后泥鰍鰭細胞系的DNA損傷情況

注：同一列中，*表示與對照組差異顯著(P<0.05),下同.

Note: * means significant different in the same column from the control group, et sequentia.

2.2 硫酸銅對泥鰍鰭細胞系MT表達量的影響

泥鰍鰭細胞系經不同濃度硫酸銅染毒處理24 h之后，細胞內金屬硫蛋白mRNA相對表達量見圖2，泥鰍細胞金屬硫蛋白的表達量隨著硫酸銅濃度的增大均呈先穩定后下降的趨勢，在硫酸銅濃度為100 μmol/L時，金屬硫蛋白表達量與對照組相比有所升高，但差異不顯著(P>0.05)。當硫酸銅濃度為200、400、800 μmol/L時，金屬硫蛋白表達量與對照組相比明顯降低(P<0.01)。

圖2 不同濃度硫酸銅對泥鰍鰭細胞內金屬硫蛋白相對表達量的影響

2.3 氯化鋅對泥鰍鰭細胞DNA損傷的影響

顯微觀察和對應的CASP彗星軟件處理結果見圖3。倒置熒光顯微鏡觀察發現，正常未凋亡的細胞經裂解液裂解并電泳后，移動距離較短，且細胞多以圓形存在(圖3a)；氯化鋅濃度為200 μmol/L時，細胞也接近圓形，但邊緣有所擴大且模糊不清(圖3b)；氯化鋅濃度為400、800 μmol/L時，細胞邊緣進一步擴大，且出現拖尾情況，尾部輪廓寬大呈放射狀(圖3c～d)；氯化鋅濃度為1600 μmol/L時，多數細胞出現明顯的拖尾情況，尾部清晰且拉長(圖3e)。綜合來看，可見隨著氯化鋅濃度的升高，彗星尾部從放射狀逐漸清晰并拉長。

軟件分析中各彗星圖片的數量指標(表2)表明，當氯化鋅濃度為200 μmol/L時，僅拖尾率與對照組差異顯著(P<0.05)，其他4個指標均與對照組差異不顯著(P>0.05)。當氯化鋅濃度為400、800、1600 μmol/L時，5個數量指標均與對照組差異顯著(P<0.05)。

圖3 氯化鋅處理后泥鰍鰭細胞系的彗星試驗結果

表2 氯化鋅處理后泥鰍鰭細胞系的DNA損傷情況

2.4 氯化鋅對泥鰍鰭細胞系金屬硫蛋白表達量的影響

金屬硫蛋白mRNA相對表達量的試驗結果見圖4，氯化鋅濃度為200 μmol/L時，泥鰍鰭細胞中金屬硫蛋白mRNA的表達量即顯著高于對照組，在400 μmol/L氯化鋅處理時其表達量達到最大值，是對照組的1.23倍，此后細胞內金屬硫蛋白表達量急劇下降，在800、1600 μmol/L時表達量顯著低于對照組，且1600 μmol/L時泥鰍鰭細胞系金屬硫蛋白相對表達量接近于0。

3 討 論

3.1 重金屬引起泥鰍細胞DNA損傷的機理

重金屬能夠誘導魚類細胞系凋亡或壞死，均可以表現為細胞內DNA損傷[8,10]。本研究彗星試驗的結果顯示，銅、鋅兩種重金屬會不同程度地引起泥鰍細胞的DNA損傷。與對照組相比，當硫酸銅濃度為200 μmol/L，氯化鋅濃度為400 μmol/L時，拖尾率、細胞彗尾DNA比例、彗星尾長、慧尾DNA比例、尾距和Olive尾距5個指標均顯著高于對照組。且泥鰍細胞的DNA損傷程度與兩種重金屬濃度之間存在明顯的劑量依賴關系，這種現象與譚鳳霞等[17-19]的研究結果類似。分析認為，銅和鋅均為生物體必需元素，參與多種酶催化的生化反應，但超過機體內必需濃度時，可誘導產生大量自由基，這些活性自由基攻擊DNA鏈使其發生斷裂，從而通過單細胞凝膠電泳可觀察到明顯的DNA損傷。

圖4 不同濃度氯化鋅對泥鰍鰭細胞內金屬硫蛋白相對表達量的影響

3.2 銅和鋅對泥鰍細胞金屬硫蛋白的誘導作用

金屬硫蛋白可以對進入生物有機體的重金屬進行捕獲和儲存，進而降低其對生物體細胞和組織的毒性作用[20]，因此在生物受到重金屬脅迫的研究中經常被作為應激反應的指標。重金屬在魚體組織器官的積累的相關研究表明，鰭組織可能不是金屬硫蛋白表達的最主要部位[21-22]，因此，本試驗對照組泥鰍鰭細胞系的金屬硫蛋白表達量很低，這與王磊[23]在活體泥鰍鰭組織中金屬硫蛋白表達量很低的報道相符。但是在重金屬刺激下，細胞金屬硫蛋白表達量會存在不同程度的誘導現象。本試驗結果顯示，硫酸銅處理后泥鰍細胞金屬硫蛋白表達量僅在低濃度時維持與對照組一致的水平，隨著硫酸銅濃度的升高金屬硫蛋白表達量顯著降低；而氯化鋅處理后，泥鰍鰭細胞金屬硫蛋白表達量顯著升高，超過一定濃度后顯著下降。說明一定范圍的氯化鋅脅迫后，泥鰍鰭細胞會通過金屬硫蛋白的表達水平維持或增加，對相應重金屬進行捕獲和解毒，從而避免了重金屬對細胞造成的DNA損傷、代謝紊亂、氧化損傷等。類似的解毒機制在Cheuk等[6,24]對斑馬魚尾鰭細胞系和肝細胞系中均有報道。超過一定濃度范圍的硫酸銅和氯化鋅處理，重金屬誘導表達的金屬硫蛋白無法繼續捕獲更多的重金屬，使得這些重金屬直接或間接地干擾DNA的遺傳控制和修復機制，同時也可能使機體產生過多的自由基而引起DNA堿基突變，這些DNA損傷的累積將最終導致細胞的死亡。

3.3 不同細胞對重金屬的敏感性差異

鋅參與DNA聚合酶、RNA聚合酶的合成，參與和維持細胞膜的結構和功能，而濃度過高時影響這兩種聚合酶的活性，直接影響膜性結構的脂質雙分子層生理穩態，導致細胞功能障礙。同時，高濃度的鋅還會影響鐵、銅、鈣等的吸收和代謝[25-26]。銅是真核生物代謝過程中重要的微量元素，是機體內蛋白質和酶的重要組成，許多關鍵的酶均需要銅的參與和活化。體內的銅主要依靠超氧化物歧化酶和金屬硫蛋白轉運，過量的銅對細胞的毒性作用表現在能量代謝降低、氧化損傷及DNA損傷[27]。可見，兩種重金屬對生物體及細胞的毒性機理不同，細胞對兩種重金屬的耐受機理也勢必會存在差異。本試驗結果顯示，硫酸銅和氯化鋅對泥鰍鰭細胞的毒性效應存在一定差異，泥鰍鰭細胞系對氯化鋅的耐受力更強，而對硫酸銅更加敏感。類似的，Park等[28]通過研究敲除金屬硫蛋白基因的小鼠發現，金屬硫蛋白對一些金屬解毒能力的順序為Cd>Zn>Cu>Ag；譚鳳霞等[7]研究了Zn2+、Cd2+、Cu2+和Cr6+4種重金屬對稀有鯽鰭細胞系的毒性作用，結果顯示，4種重金屬對稀有鯽鰭細胞的毒性效應均隨傳代數的增大而呈下降的趨勢，且4種重金屬毒性大小為Cr+6>Cd2+>Cu2+>Zn2+；這些報道與本試驗結果相似。但Tan等[5]研究了4種重金屬對草魚鰭條細胞系(GCF)、草魚腎細胞系(CIK)、鯉魚(Cyprinuscarpio)上皮瘤細胞系(EPC)、斑點叉尾(Ictaluruspunctatus)卵巢細胞系(CCO)，褐色大頭鲇(Ameiurusnebulosus)肌肉細胞系(BB)和黑頭呆魚(Pimephalespromelas)肌肉細胞系(FHM)6種魚類細胞系細胞毒性的作用，結果表明，6種細胞系對4種重金屬的敏感性大小為Cr>Cd>Zn>Cu。究其原因，可能是與動物種類、細胞種類及不同重金屬形態(價態、不同陰離子根等)有關[29-30]。

4 結 論

綜合本研究中單細胞凝膠電泳及金屬硫蛋白的表達結果，發現銅對泥鰍鰭細胞的毒性效應更大，而鋅可以通過誘導金屬硫蛋白的轉錄表達從而短暫減緩對細胞的損傷。