不同鹽度對生物絮團、對蝦生長以及酶活性的影響

秦海鵬，楊世平，王 博，廖栩崢，胡世康，趙吉臣，何子豪，孫成波

( 廣東海洋大學 水產學院，廣東 湛江 524088 )

目前，水產養殖業正在走向高密度集約化、工廠化的養殖模式，在此模式下，養殖水體水質嚴重惡化，危害養殖對蝦的健康，同時高密度養殖病害暴發日益頻繁，養殖廢水的排放對生態環境也造成了嚴重污染[1]。生物絮凝技術由以色列專家首先應用于水產養殖業之后，已經在調控水質、切斷水產病害傳播等方面展現出了巨大優勢，已成為行業研究的熱點[2]，生物絮體的核心是菌膠團細菌和絲狀細菌，它們通過分泌的胞內和胞外聚合產物等, 將異養細菌、硝化細菌、真菌、藻類、原生動物、有機聚合體、膠體、陽離子和碎屑等黏附在一起，形成結構多樣化的絮狀物[3-4]。生物絮團可以通過微生物的同化作用和硝化作用有效去除水體中的氨氮、亞硝態氮，實現水質的凈化[5-6]。

凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)為廣鹽性海水蝦類，近年來在淡水、半咸水和海水中都進行了大規模養殖。目前，關于鹽度對蝦類生物絮團養殖影響的研究主要集中于鹽度突變方面[7],而鹽度對凡納濱對蝦影響的研究主要集中于凡納濱對蝦生存、生長、能量收支和滲透壓調節等方面[8-11]。已有研究表明，生物絮團水體中氮元素的循環受到鹽度的影響；生物絮團中的生物類群和組成結構，也受到鹽度的影響，從而影響到對蝦養殖水體的水質、對蝦生長和代謝等[12]。但鹽度對凡納濱對蝦生物絮團長周期養殖的影響尚未見相關報道。筆者在不同鹽度下進行凡納濱對蝦的生物絮團養殖試驗，旨在探究不同鹽度對凡納濱對蝦生理因子的影響，以及生物絮團在不同鹽度下氮元素轉化的規律，探究生物絮團養殖凡納濱對蝦的適宜鹽度，為凡納濱對蝦生物絮團海水養殖模式的推廣提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗地點

廣東海洋大學水產學院東海島海洋生物研究基地。

1.2 試驗材料

試驗在設有防逃網的0.3 m3的藍色塑料桶中進行，用曝氣處理后的自來水稀釋消毒海水來調節鹽度，用200目的篩絹網將生物絮團自養殖池中撈取至調配好鹽度的海水中。凡納濱對蝦在不同鹽度組內經過7 d的適應期，體長(7.7±0.63) cm、體質量(6.15±1.15) g。

1.3 試驗方法

試驗設置5個鹽度梯度：10、15、20、25、30，每個梯度3個平行，飼養密度為500 尾/m3，生物絮團初始量為20 mL/L，試驗周期30 d。試驗過程中24 h連續充氣。試驗從第15 d起每日添加5 mg/L的碳酸氫鈉來調節pH和總堿度。

1.4 水質和生長指標

試驗期間，每5 d測定一次總堿度、pH、硝態氮、亞硝態氮、氨氮。在試驗開始和試驗結束時測定對蝦的體長和體質量。

氨氮的測定采用靛酚藍分光光度法；硝態氮的測定采用鋅—鎘還原分光光度法；亞硝態氮的測定采用鹽酸萘乙二胺分光光度法；總堿度的測定采用酸堿滴定法[13]。

1.5 消化和免疫指標測定

試驗結束時進行取樣，取樣時隨機挑選處于蛻殼間期的對蝦。取其肝胰臟、肌肉組織分別放入樣品管中，準確稱量質量后迅速投入液氮冷凍，再轉移到冰箱-80 ℃保存，以上操作均在冰盤中進行。取保存的組織樣品，加入9倍體積預冷的對蝦生理鹽水，在冰浴中研磨勻漿，然后4 ℃，5000 r/min離心10 min，取上清液用于對蝦消化和非特異性免疫指標的測定。所有酶活力及蛋白含量的測定均采用南京建成生物研究所研制的檢測試劑盒，按照操作步驟進行操作。

1.6 數據分析

所有數據采用Excel 2016軟件統計分析，用SPSS 19.0軟件在0.05水平上進行顯著性差異分析。

2 結果與分析

2.1 不同鹽度下凡納濱對蝦生長指標的差異

凡納濱對蝦在20鹽度組鹽度下體長的增長率最大，為20.00%，凈增體長1.54 cm，15鹽度組體長增長率最小，為15.58%，凈增體長1.20 cm，達15.58%。各鹽度下終末體長差異不顯著(P>0.05)。20鹽度組和25鹽度組的對蝦質量的增長率最大，為70.73%，凈增質量4.35 g，15鹽度組的體質量增長率最小，體質量增長3.09 g，達50.24%，各鹽度間差異不顯著(圖1)(P>0.05)。

圖1 不同鹽度下凡納濱對蝦終末體長和體質量的差異

2.2 不同鹽度下生物絮團沉降量的變化

鹽度越高生物絮團生長越快，30鹽度組的生物絮團沉降量在第17 d達到最大值，為200 mL/L，隨后逐漸降至43 mL/L，其他各鹽度組呈相同變化趨勢(圖2)。第30 d各鹽度絮團沉降量差異不顯著(P>0.05)。

圖2 不同鹽度下生物絮團沉降量的變化

2.3 不同鹽度下pH與總堿度的變化

試驗各鹽度組的pH持續降低，鹽度越低，pH降低越快，15鹽度組pH最低為7.36，15鹽度組在第11 d與20鹽度組、25鹽度組和30鹽度組差異顯著(P<0.05)，20鹽度組與25鹽度組、30鹽度組差異顯著(P<0.05)(圖3)。各鹽度組的總堿度持續降低，鹽度越低，總堿度降低越快，15鹽度組總堿度最低，達43 mg/L(以CaCO3計)(圖4)，10、15鹽度組在第11 d與20、25、30鹽度組差異顯著(P<0.05)。

圖3 不同鹽度下pH的變化

圖4 不同鹽度下總堿度的變化

2.4 不同鹽度下氨氮的變化

氨氮在30鹽度組積累的最快，在第6 d達到最大質量濃度8.62 mg/L后，在全部試驗周期中持續降低，在第21 d降至0 mg/L，10鹽度組積累的最慢，也在第6 d達到最大質量濃度1.71 mg/L，隨后在第21 d降至0 mg/L，其他鹽度組呈相同趨勢變化(圖5)。在第6 d各鹽度組之間氨氮質量濃度差異不顯著(P>0.05)。

圖5 不同鹽度下氨氮質量濃度的變化

2.5 不同鹽度下亞硝態氮的變化

亞硝態氮在10鹽度組積累的最快，在第6 d達到最大質量濃度9.18 mg/L，隨后在全部試驗周期中持續降低，在第16 d降至0 mg/L，30鹽度組積累的最慢，也在第6 d達到最大質量濃度5.79 mg/L，隨后在第16 d降至0 mg/L，其他各鹽度組呈相同變化趨勢(圖6)。30鹽度組的亞硝態氮濃度質量在第6 d顯著高于10、15、20鹽度組，25鹽度組亞硝態氮質量濃度顯著高于10鹽度組和15鹽度組，10、15、20鹽度組之間差異不顯著(P>0.05)。

圖6 不同鹽度下亞硝態氮質量濃度的變化

2.6 不同鹽度下硝態氮的變化

試驗由第1 d開始到第16 d硝態氮在不同鹽度中呈上升的趨勢，試驗前6 d硝態氮的累積為鹽度越低硝態氮質量濃度越高，10鹽度組在第6 d硝態氮質量濃度達到最大值，為15.75 mg/L，第16 d鹽度越高硝態氮質量濃度越高，30鹽度組在第30 d硝態氮質量濃度達到最大值，為58.39 mg/L，隨后開始降低，最低達28.63 mg/L(圖7)。

圖7 不同鹽度下硝態氮質量濃度的變化

2.7 鹽度對凡納濱對蝦消化指標的影響

低鹽度與高鹽度肝胰臟脂肪酶活性較高，25、30鹽度組的脂肪酶活性最高，達1.21 U/mg，顯著高于15、20鹽度組的活性，10鹽度組脂肪酶活性也高于15、20鹽度組的活性，但差異不顯著(P>0.05)(圖8)。15鹽度組的淀粉酶活性顯著高于其他鹽度組(P<0.05)，其他各鹽度組間差異不顯著(P>0.05)(圖9)。

2.8 鹽度對凡納濱對蝦超氧化物歧化酶的影響

20、25鹽度組肌肉中的超氧化物歧化酶活性顯著高于其他鹽度組(P<0.05)，20鹽度組的酶活性最高，此外10鹽度組的酶活性也較高，30鹽度組的酶活性最低(圖10)。肝胰臟中各鹽度組酶活性差異不顯著(P>0.05)，肝胰臟與肌肉中超氧化物歧化酶活性在不同鹽度下的規律相似，即先降后升再降。

圖8 鹽度對凡納濱對蝦脂肪酶活性的影響

圖9 鹽度對凡納濱對蝦淀粉酶活性的影響

圖10 鹽度對凡納濱對蝦超氧化物歧化酶活性的影響

2.9 鹽度對凡納濱對蝦過氧化氫酶的影響

30鹽度組肌肉中的過氧化氫酶活性顯著高于其他各鹽度組，其他各鹽度組差異不顯著(P>0.05)(圖11)。肝胰臟與肌肉中過氧化氫酶活性的規律接近，30鹽度組的活性也顯著高于其他各鹽度組，25鹽度組的活性低于其他各鹽度組。相同鹽度下，肌肉中過氧化氫酶的活性低于在肝胰臟中的活性。

圖11 鹽度對凡納濱對蝦過氧化氫酶活性的影響

2.10 鹽度對凡納濱對蝦堿性磷酸酶的影響

堿性磷酸酶在肌肉中的活性極低，20鹽度組的活性高于其他各鹽度組，但各組間差異不顯著(P>0.05)，堿性磷酸酶活性在不同鹽度下的規律先升后降(圖12)。肝胰臟中，堿性磷酸酶的活性在20鹽度組中最高，20、30鹽度組活性差異顯著(P<0.05)，20鹽度組與其他各組鹽度差異不顯著(P>0.05)。肝胰臟中堿性磷酸酶活性在不同鹽度下的規律為先降后升再降。

2.11 鹽度對凡納濱對蝦酸性磷酸酶的影響

酸性磷酸酶在肌肉中的活性很低，20鹽度組的活性高于其他各鹽度組且差異顯著(P<0.05)，30鹽度組的活性顯著低于其他各鹽度組(P<0.05)，酸性磷酸酶活性在不同鹽度下的規律為先升后降。肝胰臟中，酸性磷酸酶的活性在20鹽度組中最高，20鹽度組與其他各鹽度組活性差異顯著(P<0.05)，10鹽度組顯著低于其他各鹽度組(P<0.05)(圖13)。肝胰臟堿性磷酸酶活性與肌肉的規律相同，即隨著鹽度升高酶活性先升再降。

圖12 鹽度對凡納濱對蝦堿性磷酸酶活性的影響

圖13 鹽度對凡納濱對蝦酸性磷酸酶活性的影響

3 討 論

3.1 不同鹽度下凡納濱對蝦生長指標的差異

鹽度是海洋無脊椎動物生存、生長發育的重要影響因子, 鹽度變化直接影響動物體內滲透壓和離子濃度的調節[14]。已有的研究表明,凡納濱對蝦等廣鹽性蝦類可通過自身的滲透壓離子調節來適應水體的不同鹽度，水體鹽度較高時,蝦類排除體內的多余鹽分，同時增加對水分的吸收；在鹽度較低時又從水體中吸收鹽分，并排出多余的水分，來實現自身與環境的滲透壓平衡。在這個過程中,蝦類要消耗大量的能量，同時蝦類的生長也會受到影響[15]。而在處于等滲點的環境時消耗能量少，用于生長的能量比最大[16]。凡納濱對蝦最適宜鹽度的研究結果不盡相同，不同試驗條件下，凡納濱對蝦生長的最適鹽度分別為4～8[17]、2～8[18]、20[9-10]和30[19]。本試驗中，鹽度15和20的條件下，凡納濱對蝦的生長速度最快。可以得出，在生物絮團模式下凡納濱對蝦的最適生長鹽度為15～20。

3.2 不同鹽度下pH、總堿度和生物絮團結構的變化

本試驗的結果顯示，生物絮團對鹽度有廣泛的適應性，鹽度越高生物絮團生長越快。試驗所用生物絮團來源于鹽度約30的養殖池中，在與原環境鹽度相同的30鹽度組水體中絮團生長速度最快，但是不同鹽度下絮團的演替周期和轉化氮元素的周期相同，在時間上保持同步。

生物絮團在生長過程中需要消耗水體中的堿度并產生大量的二氧化碳，使水體pH和總堿度降低，與Ebeling等[20]的研究結果相似。已有研究表明，在生物絮團養殖系統中，堿度降至低于100 mg/L、pH降至低于7.0時會對對蝦的健康產生影響[21]。同時，較高的堿度可對水產養殖絮體生物學特性及氨氮轉化產生影響[22]。因此在試驗過程中需要給水體中持續添加碳酸氫鈉或者氧化鈣等來維持pH和總堿度。

3.3 不同鹽度下生物絮團養殖水體中氮元素的轉化

本試驗中，鹽度越高氨氮累積越快，鹽度越低亞硝態氮累積越快。不同鹽度下硝態氮的累積趨勢類似， 25、30鹽度組的硝態氮質量濃度自21 d起開始呈降低的趨勢。

生物絮團養殖水體中碳氮比在15以上時，以異養的方式將水體中的三態氮轉化為自身的菌體蛋白；在碳氮比低于5時主要依靠硝化作用清除無機氮[23]。本次試驗中的生物絮團通過硝化途徑來處理水體中的氮元素。生物絮團中的亞硝化細菌將氨氮轉化為亞硝態氮，硝化細菌把亞硝態氮轉化為硝態氮，伴隨著硝態氮質量濃度的增加。這與Avnimelech[5]的研究結果相似，對于試驗后期硝態氮質量濃度的降低，初步分析有兩種原因：一是反硝化細菌逐漸繁殖增加，將硝態氮進一步轉化掉[24]；二是生物絮團在試驗后期由自養型微生物群落結構向異養型的結構轉化，可直接將氮元素轉化為自身的有機氮，不需要通過硝化途徑的無機氮循環來處理水體中的氮元素[25]。水體中的細菌在繁殖過程中，不僅可以穩定水質，還可以增加凡納濱對蝦腸道菌群的組成豐度[26]。

3.4 不同鹽度對凡納濱對蝦酶活性的影響

鹽度是對蝦養殖中重要的環境因子之一，鹽度會直接影響對蝦的生長、存活、滲透壓調節、免疫和代謝酶活性等[9,27]。試驗中淀粉酶的活性隨著鹽度的升高呈先升后降的趨勢，這與侯文杰等[28]的結果相同。同時黃凱等[9]發現，低鹽度組的凡納濱對蝦淀粉酶、蛋白酶活性均高于高鹽度組，認為可能是低鹽度組維持滲透壓平衡需要消耗更多的能量，因此需要更高的淀粉酶活性用于消化食物。脂肪酶在鹽度25時活性最高，鹽度升高或者降低酶活性均隨之降低。凡納濱對蝦在鹽度為15～25時，超氧化物歧化酶、堿性磷酸酶、酸性磷酸酶活性均維持在較高水平，與沈麗瓊等[29]的研究結果相一致。消化酶與免疫酶活性的強弱決定了凡納濱對蝦對營養物質消化吸收的能力以及機體的免疫能力[30]，在鹽度15～25間較高的酶活性也表明了凡納濱對蝦的適宜鹽度，與朱春華[31]的研究結果相一致。

4 結 論

生物絮團是一種零換水的養殖技術，在解決水產養殖環境污染，減少病害的暴發，阻絕病害的傳播等方面具有獨特的優勢，因此開展生物絮團在水產養殖中的應用研究，具有極大的意義。

本試驗的結果表明，在生物絮團模式下，凡納濱對蝦的最適生長鹽度為15～20。養殖水體中不同鹽度下氨氮和亞硝態氮的累計速度有差異，試驗前期鹽度越高氨氮累積越快，鹽度越低亞硝態氮累積越快，此外生物絮團對鹽度有廣泛的適應性，不同鹽度下絮團的演替周期和轉化氮元素的周期相同，在時間上保持同步。值得注意的是，在生物絮團模式下，水體中的氮元素通過硝化途徑進行轉化，會消耗水體中的堿度并產生大量的二氧化碳，使水體pH和總堿度降低，因此在生物絮團養殖模式下，需要添加一定量的碳酸氫鈉、氧化鈣等藥品來調節水質。