不同卵巢刺激方案對高齡不孕患者卵泡液氧化應激及ART結局的影響

謝廣妹，楊杰，許思娟，安錦霞，倪亞莉

(甘肅省婦幼保健院生殖醫學中心，蘭州 730050)

近年來，隨著社會經濟的快速發展、競爭壓力的增加以及生育年齡的推遲，不孕癥發病率在逐年上升，我國女性不孕癥發病率約為15%[1-2]。以體外受精-胚胎移植(IVF-ET)為主要代表的輔助生殖技術的出現與發展造福了數千萬不孕癥家庭[2]。正常情況下，機體的氧化和抗氧化狀態保持動態平衡，當活性氧(ROS)產生過多或抗氧化能力下降時，動態平衡被打破，導致細胞出現氧化損傷，最終造成細胞功能的異常[3-4]。輔助生殖技術過程中的諸多因素都可以導致機體氧化應激的產生及ROS的增加，進而影響輔助生殖治療結局，因此，氧化應激對輔助生殖技術和人類生育潛能的影響在近年來也越來越受到關注[5]。目前，關于高齡女性患者中IVF助孕時卵泡液中氧化應激狀況及其對IVF結局影響的研究不多，且存在一定爭議，與卵巢刺激方案的不同也存在一定的關系。因此，本研究旨在關注高齡女性患者不同卵巢刺激方案的卵泡液中ROS和TAC表達水平及其與輔助生殖治療結局間的相關性。

材料和方法

一、研究對象

回顧性分析2017年1～12月在甘肅省婦幼保健院生殖醫學中心行輔助生殖治療的高齡女性患者的病歷資料。納入標準：(1)女性年齡≥35歲；(2)不孕為單純輸卵管因素；(3)男方性激素檢測正常、精液正常；(4)所有患者在3個月之內未進行任何藥物治療。排除標準：(1)子宮畸形及宮腔黏連患者；(2)患者夫婦患有其他內分泌疾病。

共納入符合標準的患者194例，按照促排卵(COH)方案不同分為短效長方案組(n=52)、拮抗劑組(n=47)、超長方案組(n=45)和高孕酮狀態下促排卵(PPOS)組(n=50)。

二、研究方法

1.促排卵方案：(1)短效長方案：于前一周黃體酮中期開始肌肉注射短效GnRH-a(達必佳，輝凌，德國)0.05～0.1 mg/d進行垂體降調節至HCG注射日，降調節14～16 d達到啟動標準后開始促排卵。(2)拮抗劑方案：于月經第1～3天開始啟動促排卵，結合陰道B超監測卵泡生長情況和血清激素水平，當卵泡≥14 mm時開始肌肉注射拮抗劑思則凱(Baxter，德國)0.25 mg/d至HCG注射日。(3)超長方案：于月經第1～3天肌肉 注射GnRH-a 3.75 mg×2～3支，最后一支注射30 d后行B超和血清激素檢測，垂體達到降調標準后開始給予外源Gn(醋酸亮丙瑞林，北京博恩特)促排卵，根據B超檢測卵泡情況以及血清激素水平調整Gn劑量。(4)PPOS方案：于月經第1～3天開始使用安宮黃體酮片(浙江仙琚制藥)10 mg/d和注射用尿促性素(寧波人健藥業)225 U/d 至HCG扳機日。2種藥物劑量在促排卵過程中保持恒量。根據卵泡直徑、血清激素水平確定扳機時間。

2.資料采集及卵泡液收集：采集所有患者的年齡、不孕年限、基礎內分泌等資料。取卵日早晨空腹收集卵泡液，超聲引導下首先穿刺位置最低的1枚大卵泡(直徑在20 mm左右)，穿刺時穿刺針盡量避開血管，適當壓力抽吸，抽吸干凈后，將無血液污染的卵泡液送入胚胎實驗室單獨放置，并標注姓名，日期等相關信息。解剖鏡下卵母細胞尋找完成后，立即將卵泡液于300g離心20 min，隨后取上清液分裝至無菌Eppendoff 管中，置于-80℃冷凍保存。批量檢測，避免反復凍融，以保證測定的可靠性和穩定性。

3.主要評價指標：記錄患者行促排卵時的Gn時間、Gn總量、AMH、竇卵泡數(AFC)、獲卵數、成熟卵數、受精數、卵裂數及臨床妊娠率等。

4.氧化應激檢測：提取中心保存的194例患者血清樣本，送至甘肅省婦幼保健院臨床檢驗中心。采用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測各組卵泡液中活性氧ROS、超氧化物歧化酶SOD、總抗氧化能力TAC、谷胱甘肽GSH以及丙二醛MDA含量。ELISA試劑盒均購自江蘇酶免實業有限公司，具體步驟按試劑盒說明書操作。

三、統計學處理

結 果

一、各組患者的基本臨床資料

統計結果顯示，各組患者的年齡、不孕年限、LH和PRL水平均無顯著性差異(P>0.05)；超長方案組FSH水平顯著高于其余3組(P<0.05)，但其余3組間的FSH水平無顯著差異(P>0.05)；短效長方案組和PPOS組E2水平顯著高于拮抗劑組和超長方案組(P<0.05)，但短效長方案組和PPOS組、拮抗劑組和超長方案組間E2水平均無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

表1 各組患者一般情況(-±s)

注：與超長方案組比較，*P<0.05；與短效長方案組和PPOS組比較，#P<0.05

二、各組促排卵情況

組間分析結果顯示：與短效長方案組相比，拮抗劑方案組、超長方案組和PPOS方案組的Gn時間顯著升高(P<0.05)，AFC顯著降低(P<0.05)；與拮抗劑方案相比，超長方案組的AFC顯著升高(P<0.05)，而PPOS方案組的Gn時間和AFC均無顯著性差異(P>0.05)；與超長方案組相比，PPOS方案組的Gn時間無顯著性差異(P>0.05)，AFC顯著降低(P<0.05)；各組間的Gn總量和AMH水平均無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

表2 各組患者促排卵情況比較(-±s)

注：與短效長方案組比較，*P<0.05；與拮抗劑組比較，#P<0.05；與超長方案組比較，△P<0.05

三、不同促排卵方案對卵泡液氧化應激水平的影響

氧化應激指標分析結果表明：與短效長方案組相比，拮抗劑方案組ROS、MDA含量顯著升高(P<0.05)，超長方案組SOD含量顯著升高(P<0.05)；與拮抗劑方案組相比，超長方案組ROS和MDA含量均顯著降低，而GSH、SOD和TAC含量均顯著升高(P<0.05)，PPOS方案組中僅MDA濃度顯著降低(P<0.05)；與超長方案組相比，PPOS方案組僅SOD含量顯著降低(P<0.05)，其余指標均無顯著性差異(P>0.05)。

四、不同超促排卵方案ART結局比較

不同超促排卵方案ART各指標統計分析結果顯示：與短效長方案相比，拮抗劑方案獲卵數、受精率、優質胚胎率和臨床妊娠率均顯著降低(P<0.05)，超長方案組除卵裂率外其余指標均顯著升高(P<0.05)，PPOS組獲卵數顯著升高，而受精率、優質胚胎率和臨床妊娠率均顯著降低(P<0.05)；與拮抗劑方案相比，超長方案組除卵裂率外其余指標均顯著升高(P<0.05)，PPOS組僅獲卵數顯著升高(P<0.05)而其余指標無顯著性差異；與超長方案相比，PPOS方案獲卵數、卵成熟率、受精率、優質胚胎率和臨床妊娠率均顯著降低(P<0.05)；卵裂率在各組之間均無顯著性差異(P>0.05)(表4)。

表3 不同促排卵方案之間卵泡液氧化應激水平的比較(-±s)

注：與短效長方案組比較，*P<0.05；與拮抗劑相比，#P<0.05；與超長方案組比較，△P<0.05

表4 不同促排方案之間ART結局的比較[(-±s)，%]

注：與短效長方案組比較，*P<0.05；與拮抗劑相比，#P<0.05；與超長方案組比較，△P<0.05

討 論

隨著時代的發展，女性社會角色的轉換，越來越多的婦女推遲生育年齡，加上二胎政策的放開，使得就診不孕人群日漸增多[6]。女性生育能力隨著年齡的增長而下降，在輔助生殖項目中，高齡婦女妊娠率和植入率都要比年輕患者低得多[7]。目前，雖然對于女性高齡生育年齡沒有確切的定義，但諸多經典的大樣本流行病調查認為，35歲以上婦女卵巢的儲備卵泡數目和卵母細胞質量明顯下降，成為影響其妊娠結局的關鍵因素。隨著年齡的增加，女性不孕癥發生率明顯增高，有文獻報道，35～39歲女性不孕癥發生率約為30%，40～44歲女性的不孕率高達64%[8]。因此，選擇輔助生殖技術助孕的高齡不孕患者也隨之增多。

促排卵的目的是應用促排卵藥物使多個卵泡同步發育成熟，獲得多個卵細胞，從而獲得更多可供移植的胚胎，提高臨床妊娠率[9]。選擇個體化的刺激方案是輔助生殖技術中的重點。GnRH-a長方案、GnRH-a短方案以及拮抗劑方案是目前臨床上常用的方案。陳軍等[9]研究發現，卵巢竇卵泡數不同患者行上述3種超促排卵方案時獲卵數、優質胚胎率均無顯著性差異；拮抗劑方案臨床妊娠率高于GnRH-a長方案和GnRH-a短方案，但無顯著差異。孫艷蘭等[10]研究發現，對子宮內膜異位癥患者行不同超促排卵后，短方案組FSH水平、LH值顯著高于超長方案，而竇卵泡數、Gn天數、Gn用量及獲卵數均顯著低于超長方案。本研究發現，短效長方案組和超長方案組的成熟卵率、受精率和優質胚胎率顯著高于拮抗劑方案組；短效長方案組Gn時間顯著高于其他3組，竇卵泡數均顯著低于后者；短效長方案組和超長方案組的臨床妊娠率顯著高于拮抗劑方案和PPOS方案；各組AMH、Gn總量及卵裂率均無顯著性差異。我們的研究結果和以往研究基本一致[11-12]。

氧化應激是活性氧產生過多或抗氧化能力受損而引起的一種氧化/抗氧化失衡狀態[13-14]。近年來，在腹膜液、卵泡液和輸卵管積水等重要的生殖微環境內都檢測到ROS的存在[15-17]。氧化應激可以引起一系列女性生殖相關疾病，如子宮內膜異位癥、不明原因性不孕等[18]。卵泡液內氧自由基和清除劑含量可直接影響卵母細胞的生長和發育潛力[19]。有研究表明，氧化應激可能通過誘導染色體和線粒體DNA的損傷而直接降低PCOS患者的生育能力[4]。已有研究證實，卵泡微環境中氧化和抗氧化平衡狀態和卵子成熟度相關，同時，受精率和妊娠率也隨著抗氧化水平的升高而增加[20-21]。此外，還有研究表明，顆粒細胞的氧化應激能夠導致DNA氧化產物含量的增加，最終導致受精率和細胞質量的降低[22]。ROS的增加和抗氧化能力的減弱可引起高齡女性卵母細胞質量的降低[3]。Lai等[17]的研究也發現PCOS患者顆粒細胞中ROS水平的升高，極大地誘導了細胞凋亡，進而影響卵母細胞質量，降低了PCOS女性IVF-ET妊娠結局。本研究發現，拮抗劑方案組的ROS含量明顯高于短效長方案組、超長方案組以及PPOS方案組，臨床妊娠率顯著低于短效長方案組和超長方案組，和PPOS方案組雖無顯著性差異，但仍相對較低。這表明，高齡女性采用拮抗劑方案時，相比其他各方案，卵泡液氧化應激水平越高，ART結局較差。

研究表明，哺乳動物卵母細胞和胚胎細胞內部存在非酶性抗氧化物(維生素、半胱氨酸等)和酶性抗氧化物(SOD、GSH等)可以拮抗ROS的產生[23]。SOD能夠反映機體抗氧化和氧化水平、清除體內自由基，進而避免卵細胞遭遇氧化應激的傷害[16]。Matos等[24]研究發現，高齡女性顆粒細胞中SOD水平低于正常值。我們的研究發現，高齡女性患者行不同促排卵方案時，超長方案組的抗氧化水平(SOD、TAC、GSH)顯著高于拮抗劑組、短效長方案組和PPOS方案組，而且該方案下的成熟卵率、受精率，優質胚胎率和臨床妊娠率也均高于拮抗劑組和PPOS方案組，表明高齡患者體內的抗氧化水平和ART結局具有一定的關聯性。

總之，行不同超促排卵方案的高齡女性患者間氧化應激水平和ART結局存在差異，其中超長方案組的FSH水平、優質胚胎率、臨床妊娠率均高于短效長方案組、拮抗劑組和PPOS組，前者的抗氧化水平同樣高于后者。因此，我們推測，超長方案更適用于高齡女性不孕患者，可以獲得較好的妊娠結局，而且妊娠結局和氧化應激水平具有一定的相關性。