HPLC-DAD法同時檢測餅干中10種合成色素

李世娟 王延龍 齊偉杰

摘 要：建立了食品中10種合成色素（檸檬黃、新紅、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍、酸性紅、赤蘚紅與酸性橙Ⅱ）的高效液相色譜法。本法定量檢出限為：0.4～0.6 mg/kg，10種色素在1～20 mg/L范圍內線性關系良好，相關系數均高于0.999，加標回收率為88.4%～96.1%，相對標準偏差為0.83%～5.24%。本方法檢測簡便、快速、準確、特異性強，非常適用于樣品數量大、檢測項目多的食品檢測機構。

關鍵詞：HPLC-DAD；合成色素；食品

目前，檢測合成色素的國標方法有液相色譜法、液相色譜-質譜/質譜法、微柱色譜法等，但大多數方法僅能同時檢測少數幾種色素。因此，針對基層食品檢測實驗室人員少，樣品種類多，檢測項目復雜，工作量大的現狀，研究出了能同時檢測食品中的10種常見人工合成色素的方法，能夠大大縮減檢測周期、減低檢測成本、提高檢測效率。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

液相色譜儀U-3000配DAD檢測器（美國Thermo Fisher Scientific公司）；C18色譜柱（5 μm，250 mm×4.6 mm，Diamonsil Plus公司）；KQ-700DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TGL-20M低溫離心機（湖南凱達科學儀器有限公司）。

1.2 試劑

甲醇（色譜純），乙酸銨（色譜純），屈臣氏超純水。

石油醚、乙酸鋅、亞鐵氰化鉀、氨水、乙醇均為分析純。

乙酸銨溶液（10 mmol/L）：0.77 g乙酸銨加水溶解定容至1 000 mL，并超聲10 min。

乙醇-氨溶液： 取1 mL氨水，加入到100 mL 70%乙醇中。

亞鐵氰化鉀溶液（106 g/L）：稱取106 g亞鐵氰化鉀[K4Fe（CN）6·3H2O]加水至1 000 mL。

乙酸鋅溶液（220 g/L）：稱取220 g乙酸鋅[Zn（CH3COO）2·2H2O]溶于少量水中，加入30 mL冰乙酸，加水稀釋至1 000 mL。

1.3 樣品處理

稱取2.0 g粉碎后的樣品于15 mL離心管，加入8 mL乙醇-氨溶液，渦旋均勻后超聲提取10 min，加亞鐵氰化鉀溶液和乙酸鋅溶液各1.0 mL，混勻后于5 000 r/min離心5 min，取適量上清液過0.22 μm濾膜，上機。

1.4 標準曲線

將濃度分別為1.0、2.0、5.0、10.0 μg/mL與20.0 μg/mL的標準系列溶液進行液相分析，以峰面積與標準系列溶液濃度進行線性回歸分析。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優化

2.1.1 流動相的確定

實驗發現，水相中乙酸銨的濃度在10～20 mmol/L范圍內時，各組分均有較好的分離效果，但在梯度洗脫條件下，高濃度的乙酸銨流動相在有機相比例波動較大的情況下混合析出結晶，從而降低色譜柱的使用壽命，因此，水相中乙酸銨的濃度設定為10 mmol/L。

2.1.2 柱溫的確定

考察了柱溫為25、30、35 ℃和40 ℃時各組分的分離效果，發現柱溫在此范圍內均能有效分離，隨著溫度的升高，出峰時間略微縮短，但柱溫為30 ℃時各組分的峰形尖銳且分離度較好，因此選擇柱溫為 35 ℃。

2.1.3 檢測波長的確定

使用DAD檢測器對各組分標準溶液在210～600 nm下進行光譜掃描，測得各組分最佳吸收波長分別為檸檬黃428 nm、新紅523 nm、莧菜紅534 nm、胭脂紅513 nm、日落黃494 nm、誘惑紅509 nm、亮藍595 nm、酸性紅512 nm、赤蘚紅529 nm以及酸性橙492 nm。再根據各組分出峰順序，發現部分組分在可見光區內的最佳吸收波長范圍有重合，經過多次優化，設定出可見紫外檢測程序。見表1。

2.1.4 色譜圖

通過高效液相色譜分離，二極管陣列檢測器檢測，優化色譜條件后10種人工合成色素得到有效分離，10種合成色素混合標準溶液的色譜圖如圖1所示，樣品在400～600 nm波長下無明顯雜質干擾。

2.2 樣品處理條件的優化

2.2.1 提取液的選擇

分別用去離子水，1%氨水和乙醇-氨溶液提取樣品，發現去離子水和1%氨水對赤蘚紅和酸性橙Ⅱ的提取率偏低，乙醇-氨溶液能用有效提取所有色素，同時具有一定的沉淀蛋白的作用。

2.2.2 沉淀劑的優化

分別用0.5、1.0、1.5 mL與2.0 mL沉淀劑進行實驗，1.0 mL沉淀劑能夠有效去除樣品中蛋白，沉淀劑過多會使色素的回收率降低。

2.3 標準曲線的線性范圍和檢測限

對混合標準系列溶液在色譜條件下進行進樣分析，以溶液濃度為橫坐標，以相應的峰面積為縱坐標進行線性回歸，回歸方程及相關系數見表2。

3倍信噪比時所對應的濃度為出檢出限。

2.4 回收率及精密度實驗

分別稱取空白樣和加標樣各2份，其中2份加標樣分別加入100 μL濃度為1 mg/L的10種色素混標溶液，按照1.3進行處理后上機檢測，結果取平均值，計算回收率。對其中一份加標樣平行檢測6次，計算RSD值，相關結果見表3。

3 小結

本方法簡化了前處理步驟，不需要再進行固相萃取和濃縮步驟，大大縮短了前處理時間。采用絕大部分干擾物無響應的400～600 nm的波長進行檢測，避免大部分食品添加劑和天然色素的干擾。結果表明，該方法準確、快速、簡便、定量結果可靠，非常適合同時處理多批次樣品。