青蒿琥酯對痤瘡丙酸桿菌的體外抑菌作用及機制研究

陳向明，何 萍，李 婷，張海清，胡 陽

（上海市嘉定區南翔醫院皮膚科，上海 201802）

痤瘡丙酸桿菌是一種厭氧革蘭陽性細菌，被認為是痤瘡的主要致病菌[1]，可導致炎癥性痤瘡和皮膚細胞損傷[2]。由于抗菌藥物的過度使用，痤瘡丙酸桿菌耐藥問題日益嚴重。青蒿琥酯是青蒿素的衍生物，具有高安全性和良好的藥物耐受性。有研究結果顯示，青蒿琥酯片與鹽酸多西環素治療酒渣鼻效果相當[3]，而患者對痤瘡丙酸桿菌敏感與酒渣鼻的發病機制有關[4]。本研究擬分析青蒿琥酯對痤瘡丙酸桿菌體外存活、生長的影響，評估青蒿琥酯與鹽酸多西環素聯合使用的抑菌效果，并通過掃描電鏡進一步觀察青蒿琥酯對痤瘡丙酸桿菌微觀形態的影響，以探索青蒿琥酯用于治療痤瘡的臨床意義。

1 材料和方法

1.1 實驗菌株

痤瘡丙酸桿菌標準株（ATCC 11827）由上海市臨床檢驗中心提供，臨床菌株分離自上海市嘉定區南翔醫院痤瘡患者皮損組織。

1.2 主要儀器與試劑

基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜系統（德國布魯克-道爾頓公司），S-4800掃描電子顯微鏡（日本日立公司），比濁儀（法國生物梅里埃公司）。青蒿琥酯（日本化成工業株式會社公司），鹽酸多西環素注射液（海南通用康力制藥有限公司）、厭氧菌培養肉湯（美國BD公司）、普通和厭氧血瓊脂平板（上海伊華科技有限公司），厭氧袋（法國生物梅里埃公司），革蘭染色液（美國BD公司）。

1.3 方法

1.3.1 臨床株的分離、鑒定與保存 從痤瘡患者皮損組織中取分泌物，接種于厭氧血瓊脂平板，置厭氧袋內，37℃厭氧培養48 h后，取單個疑似菌落分別接種于普通和厭氧血瓊脂平板的同一位置，分別置CO2和厭氧環境中孵育24～48 h。取厭氧菌進行革蘭染色鏡檢，并挑取純化培養的單個菌落通過基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜系統鑒定細菌。鑒定后的痤瘡丙酸桿菌置-80℃保存。

1.3.2 藥物最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）測定 采用微量肉湯稀釋法測定青蒿琥酯和鹽酸多西環素對痤瘡丙酸桿菌的MIC。將100 μL肉湯加入96孔聚苯乙烯板的每個待測孔，第1列每孔加藥物100 μL，然后連續倍比稀釋，共稀釋11個濃度，青蒿琥酯、鹽酸多西環素初始濃度分別為48 mg/mL、2.6 μg/mL，每藥1板。加樣細菌的濃度為105CFU/mL，加樣量為100 μL，37℃厭氧培養48 h后觀察培養結果，以不出現渾濁的最低濃度為藥物的MIC，每株菌設2個平行試驗，同時設陰性對照和陽性對照。

1.3.3 聯合藥物敏感性試驗 采用棋盤式微量稀釋法測定青蒿琥酯和鹽酸多西環素聯合使用的體外抗菌活性，重復測定2次，各藥物的起始濃度為對應的MIC的2倍。試驗結果以分級抑菌濃度（fractional inhibitory concentration，FIC）指數作為聯合藥物敏感性試驗結果的判斷依據。FIC指數≤0.5為協同作用，0.5＜FIC指數≤1為相加作用，1＜FIC指數≤2為無關作用，FIC指數＞2為拮抗作用。FIC指數=（A藥聯合的MIC/A藥單測MIC）+（B藥聯合的MIC/B藥單測MIC）

1.3.4 青蒿琥酯和鹽酸多西環素對痤瘡丙酸桿菌生長動態的影響 分別觀察痤瘡丙酸桿菌標準株在青蒿琥酯、鹽酸多西環素單獨用藥與聯合用藥中的動態生長情況。將含對數生長期的痤瘡丙酸桿菌標準株菌液100 μL（濃度為105CFU/mL）接種到100 μL含有相應藥物的肉湯中培養，藥物終濃度為相應MIC，以不加藥物為對照。在培養12、24、48、72 h后分別取培養液10 μL，105倍稀釋后，取200 μL稀釋菌液涂布于厭氧血瓊脂平板上，37℃厭氧培養48 h后計數（CFU/mL）。

1.3.5 電鏡觀察 將100 μL痤瘡丙酸桿菌標準菌液（濃度為105CFU/mL）加到2 mL厭氧培養肉湯中厭氧培養24 h，然后加入青蒿琥酯，使藥物濃度為MIC，分別于培養12、24 h后收集培養液，以不加藥物的細菌培養液為對照。收集的菌液1000×g離心10 min留取細菌，細菌用2%戊二醛固定2 h后送掃描電鏡室試樣制備并掃描觀察。

1.4 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行統計分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 菌種鑒定結果

采用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜系統對臨床分離的13株疑似痤瘡丙酸桿菌菌株進行鑒定，鑒定結果均為痤瘡丙酸桿菌。部分結果見圖1。

2.2 形態學變化

掃描電鏡觀察可見受試菌株經青蒿琥酯作用12 h后，菌體均發生改變，表面出現凹陷。作用24 h后，可見菌體較對照菌體短約1.5～2.0 μm，表面凹凸不平，有凹陷、彎折，對照菌體長4～5 μm，表面光滑、飽滿。見圖2。

圖1 痤瘡丙酸桿菌臨床分離株質譜鑒定圖譜（部分）

圖2 掃描電鏡觀察結果

2.3 體外抑菌試驗結果

青蒿琥酯、鹽酸多西環素單獨用藥對痤瘡丙酸桿菌的MIC分別為（1.071±0.688）mg/mL、（0.074±0.041）μg/mL，均高于聯合用藥的MIC[（0.335±0.207）mg/mL、（0.021±0.014）μg/mL]（P＜0.01）。鹽酸多西環素和青蒿琥酯聯合使用可抑制14株痤瘡丙酸桿菌生長，對3株菌呈協同作用，對11株菌呈相加作用。見表1。

2.4 兩藥單獨及聯合使用起效時間比較

青蒿琥酯的抑菌特點是緩慢但持續，鹽酸多西環素的抑菌特點是快速起效，兩藥聯合使用后，降低了各藥濃度，同時綜合了兩藥的特點，可快速、持續地抑菌，抑菌效果優于兩藥單獨使用。見圖3。

表1 青蒿琥酯和鹽酸多西環素單獨用藥和聯合用藥的MIC

圖3 青蒿琥酯、鹽酸多西環素單用和聯合使用的時間-抑菌曲線

3 討論

青蒿琥酯是全球公認的新型抗瘧藥物。目前國外對該藥的研究主要集中于其抗瘧活性，因高安全性和良好的藥物耐受性而被關注[5]。近年來的研究發現該藥具有抗寄生蟲、抗癌、抗病毒和抗過敏的作用。李斌等[6]發現青蒿琥酯與不同抗菌藥物有協同抗菌作用。呂品等[7]發現青蒿琥酯對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistantStaphylococcus aureus，MRSA）有體外抑菌活性，與頭孢西丁聯合使用可降低MIC。青蒿琥酯對痤瘡丙酸桿菌的作用目前尚未見報道。本研究結果顯示，青蒿琥酯對痤瘡丙酸桿菌的MIC為0.750～3.000 mg/mL，證實了既往青蒿琥酯治療酒渣鼻的研究推斷出的青蒿琥酯對痤瘡丙酸桿菌有抑菌作用的結論。

青蒿琥酯的抗瘧機制為分子結構中含有的過氧橋結構，在游離鐵或者血紅素結合鐵的介導下，發生斷裂，產生自由基，直接作用于瘧原蟲的膜系結構，導致膜結構的破壞。基于這一機制，蔣為薇[8]發現高濃度的青蒿琥酯對MRSA WHO-2菌的細胞壁有輕微的破壞作用，但在細菌敏感的濃度下對菌膜的破壞作用不明顯。本研究掃描電鏡觀察結果顯示，細菌敏感濃度的青蒿琥酯對痤瘡丙酸桿菌的細胞壁有輕微的破壞，可能是細菌種類不同造成的。本研究發現，加入青蒿琥酯培養的痤瘡丙酸桿菌較未加青蒿琥酯培養的痤瘡丙酸桿菌菌體的長度短。SILVA等[9]發現千層香精油作用于單核細胞增生李斯特菌時會使細菌變小，表明細菌在不利生長的環境中可改變菌體大小，與本研究結果一致，提示青蒿琥酯可能具有影響痤瘡丙酸桿菌形態的毒性。

本研究結果顯示，青蒿琥酯和鹽酸多西環素聯合作用于14株痤瘡丙酸桿菌，其中3株呈協同作用，11株呈相加作用。有研究結果證實由細胞外基質組成的生物膜在痤瘡丙酸桿菌的發病機制中起重要作用[10]。與浮游細菌相比，生物膜基質中存在的細菌可增加對常規抗菌藥物的耐受性[11]，同時增加消化酶產量[12]。青蒿琥酯已被證實能夠降低革蘭陽性桿菌銅綠假單胞菌的黏附性，并可破壞成熟生物膜結構[13]。本研究團隊后續將對青蒿琥酯是否對痤瘡丙酸桿菌生物膜的形成具有抑制作用，對成熟生物膜活性是否有影響，從而增加細菌對抗菌藥物的敏感性作進一步研究。

既往研究發現細菌一氧化氮可以對抗藥物的殺菌或抑菌作用，青蒿琥酯可結合細菌的一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）的血紅素基團滅活NOS，減少地衣芽孢桿菌產生一氧化氮，可逆轉一氧化氮介導的抗菌藥物的滅活作用，而增強利福平的抗菌作用[14]。有研究發現痤瘡丙酸桿菌能夠通過活性氧依賴的NF-κB級聯反應誘導iNOS、一氧化氮的表達[15]，因此青蒿琥酯與鹽酸多西環素對痤瘡丙酸桿菌聯合作用的效果也值得進一步研究。