陰道微生物芯片技術(shù)在陰道分泌物念珠菌檢測(cè)中的應(yīng)用

陳雷鳴，陳藝升，李 翠

（復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200011）

陰道炎是臨床常見(jiàn)婦科炎癥，主要分為細(xì)菌性陰道炎、真菌（念珠菌）性陰道炎和滴蟲(chóng)（陰道毛滴蟲(chóng)）性陰道炎。有研究結(jié)果表明，由念珠菌感染引起的念珠菌性陰道炎占女性陰道炎的20%～45%[1-2]。有75%的成年女性一生中至少會(huì)經(jīng)歷1次真菌性陰道炎，其中有40%～50%還會(huì)再次感染，約有5%會(huì)因復(fù)發(fā)而發(fā)展為頑固性真菌感染[3]。因此，及時(shí)、準(zhǔn)確的診斷對(duì)有效治療念珠菌性陰道炎具有重要意義。

念珠菌性陰道炎的診斷以臨床癥狀和體征為基礎(chǔ)，并經(jīng)陰道分泌物病原學(xué)檢查確診。目前，臨床主要通過(guò)陰道分泌物顯微鏡鏡檢和真菌（念珠菌）顯色培養(yǎng)2種方法常規(guī)檢查念珠菌。顯微鏡鏡檢法成本低、操作簡(jiǎn)單，但易受檢驗(yàn)者經(jīng)驗(yàn)和涂片制作質(zhì)量的影響，且敏感性較低，容易因假陰性而漏診。真菌培養(yǎng)法敏感性和特異性較高，可對(duì)念珠菌進(jìn)行定性及定量檢測(cè)，但成本高、操作復(fù)雜、培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，常需要5 d才能出具完整報(bào)告。為了滿足實(shí)際需求，臨床亟待快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確性高的檢測(cè)方法用于念珠菌性陰道炎的診斷。陰道微生物芯片檢測(cè)技術(shù)以核酸雜交原理為基礎(chǔ)，可捕獲念珠菌屬獨(dú)特的基因序列，具有敏感性高、特異性好、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。本研究擬比較陰道分泌物涂片鏡檢、念珠菌顯色培養(yǎng)和陰道微生物芯片檢測(cè)3種方法診斷念珠菌感染的效能，以探索快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確性高的檢測(cè)方法，為提高念珠菌性陰道炎的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)水平提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

收集2017年12月—2018年7月于復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院門診就診的疑似陰道炎患者233例，采用無(wú)菌拭子采集患者陰道分泌物，采集后立即送檢。

1.2 儀器與試劑

自配10% KOH溶液，酵母菌顯色培養(yǎng)基購(gòu)自梅里埃（上海）生物制品有限公司，陰道微生物檢測(cè)試劑盒（BD Affirm VP Ⅲ）及微探針自動(dòng)處理儀購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.3 方法

1.3.1 常規(guī)鏡檢法 陰道分泌物用生理鹽水涂片，顯微鏡下進(jìn)行常規(guī)鏡檢，滴加1滴10%KOH溶液混合后鏡檢，以提高陽(yáng)性率，發(fā)現(xiàn)卵圓形真菌孢子、芽生孢子及假菌絲，判讀為陽(yáng)性；無(wú)孢子或假菌絲，則判讀為陰性[4-5]。

1.3.2 真菌顯色培養(yǎng)法 將陰道分泌物接種于酵母菌顯色培養(yǎng)基上，35℃培養(yǎng)24～48 h，根據(jù)培養(yǎng)基上有無(wú)真菌生長(zhǎng)判定結(jié)果[5]。

1.3.3 陰道微生物芯片法 按照BD Affirm VPⅢ檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作和結(jié)果判讀。將裂解液加入采樣管，80℃加熱裂解樣本10 min，加入緩沖液混合震蕩，將過(guò)濾后的液體加入試劑板盒，再加入顯色液，插入試劑板，放入微探針自動(dòng)處理儀運(yùn)行程序，程序結(jié)束后根據(jù)陰陽(yáng)性對(duì)照判讀結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用x2檢驗(yàn)和Kappa一致性檢驗(yàn)。Kappa值≥0.75，說(shuō)明一致性較好；Kappa值＜0.40，說(shuō)明一致性不理想；Kappa值為0.40～0.74，說(shuō)明一致性在可接受范圍內(nèi)。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線下面積評(píng)價(jià)3種方法診斷念珠菌感染的效能。

2 結(jié)果

2.1 3種方法檢測(cè)結(jié)果比較

以顯色培養(yǎng)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)鏡檢法和陰道微生物芯片法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，Kappa值分別為0.415和0.821，陰道微生物芯片法與顯色培養(yǎng)法具有較高的一致性；與顯色培養(yǎng)法比較，鏡檢法陽(yáng)性率較低（P＜0.001）。見(jiàn)表1。

表1 3種方法檢測(cè)結(jié)果比較 例

2.2 ROC曲線分析

鏡檢法、陰道微生物芯片法診斷念珠菌感染的ROC曲線下面積分別為0.73、0.92，陰道微生物芯片法臨床應(yīng)用價(jià)值更高。見(jiàn)圖1。

圖1 陰道微生物芯片法和鏡檢法診斷念珠菌感染的ROC曲線

3 討論

由真菌引起的陰道炎被稱為念珠菌性陰道炎或真菌性陰道炎，是陰道感染的第二大病因[6]。及時(shí)、準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)室診斷對(duì)臨床及時(shí)進(jìn)行抗真菌治療有重要意義。

顯微鏡鏡檢是常規(guī)檢測(cè)念珠菌最直觀的方法，10 min即可出具報(bào)告，操作簡(jiǎn)單、成本低。近年來(lái)，隨著抗真菌藥物的過(guò)度使用，耐藥菌株不斷增多，鏡下觀察孢子結(jié)構(gòu)常不典型，鑒別診斷比較困難，易造成漏檢，對(duì)檢驗(yàn)人員的經(jīng)驗(yàn)要求較高。而熱帶念珠菌、光滑念珠菌和克柔念珠菌等不生長(zhǎng)菌絲的念珠菌，鏡檢漏檢率更高[7]，大大延誤了臨床診斷與治療。真菌顯色培養(yǎng)法是檢測(cè)念珠菌的金標(biāo)準(zhǔn)，可以進(jìn)行菌種鑒定和體外藥物敏感性試驗(yàn)，并可指導(dǎo)臨床用藥，避免耐藥菌株的出現(xiàn)，尤其針對(duì)頑固性、復(fù)發(fā)性念珠菌感染更為有效，但檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，一般需要4～5 d才能出具完整報(bào)告，不利于疾病的早期診斷和治療。而且，真菌顯色培養(yǎng)法檢驗(yàn)操作流程較繁瑣，成本較鏡檢法高，且需要檢驗(yàn)人員具有相應(yīng)的微生物檢驗(yàn)專業(yè)技能。

陰道微生物芯片技術(shù)是以核酸雜交原理為基礎(chǔ)，采用與念珠菌獨(dú)特的基因序列互補(bǔ)的2個(gè)不同的捕獲探針和顯色探針，通過(guò)顯色反應(yīng)判讀結(jié)果，成本較鏡檢法和培養(yǎng)法高，但1 h即可出具報(bào)告，操作簡(jiǎn)便、敏感性高、特異性好，且對(duì)檢驗(yàn)人員專業(yè)要求不高，可操作性強(qiáng)。

本研究結(jié)果顯示，鏡檢法假陰性率為53.9%，敏感性為46.1%，與顯色培養(yǎng)法結(jié)果的符合率為68.9%；陰道微生態(tài)芯片法檢測(cè)念珠菌的假陰性率為16.4%，敏感性和特異性分別為83.6%和100.0%，與顯色培養(yǎng)法結(jié)果的符合率為90.7%，結(jié)果一致性較高。CARTWRIGHT等[7]報(bào)道陰道微生物檢測(cè)試劑盒檢出念珠菌屬的敏感性、特異性和準(zhǔn)確性分別可達(dá)到82.3%、98.4%和95.2%，與本研究結(jié)果基本一致。ROC曲線分析結(jié)果顯示，陰道微生物芯片法診斷念珠菌感染的曲線下面積為0.92，具有較高的診斷價(jià)值，而鏡檢法診斷念珠菌感染的曲線下面積僅為0.73。

念珠菌為條件致病菌，一般情況下無(wú)臨床癥狀不需要治療，但其繁殖到一定數(shù)量時(shí)，可引發(fā)真菌性陰道炎。無(wú)癥狀患者陰道分泌物念珠菌濃度＜1×103CFU/mL，有癥狀患者濃度≥1×104CFU/mL[8]，但念珠菌培養(yǎng)均為陽(yáng)性。陰道微生物芯片檢測(cè)試劑盒對(duì)于念珠菌的分析靈敏度在每次檢測(cè)的對(duì)數(shù)期內(nèi)為1×104CFU/mL[9]，因此陰道微生物芯片檢測(cè)技術(shù)可以避免因培養(yǎng)陽(yáng)性而造成的念珠菌性陰道炎臨床診斷的假陽(yáng)性結(jié)果。本研究中顯色培養(yǎng)陽(yáng)性而陰道微生物芯片法結(jié)果為陰性的21例樣本，即是上述原因造成。

鏡檢法雖然操作簡(jiǎn)單、方便快捷，但是由于陰道分泌物樣本中各種細(xì)胞易造成干擾，且受檢驗(yàn)人員專業(yè)素質(zhì)、環(huán)境等因素影響較大，易造成漏檢和誤檢，比較適合大規(guī)模篩查。真菌培養(yǎng)法陽(yáng)性率和準(zhǔn)確度高，但其缺點(diǎn)是操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)。陰道微生物芯片技術(shù)通過(guò)檢測(cè)特異性基因序列，檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)僅為1 h，極大地提高了檢測(cè)效率，突破了傳統(tǒng)檢測(cè)方法的局限性。同時(shí)，陰道微生物芯片法還可以同時(shí)檢測(cè)陰道毛滴蟲(chóng)和陰道加德納菌，有助于3種常見(jiàn)真菌性陰道炎的臨床診斷。

目前，傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)無(wú)法滿足臨床需要，陰道微生物芯片技術(shù)有助于念珠菌性陰道炎的早期診斷，具有較高的實(shí)用價(jià)值。