自動圖像分析系統與快速流式細胞術在白細胞減少性疾病診治中的價值

郭 平，陳驪婷，廖 兵，王劍飚

（1.上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院檢驗科，上海 200025；2.上海交通大學基礎醫學院，上海 200025）

近年來用于白細胞分類的新技術不斷涌現出來，自動圖像分析系統和快速流式細胞術是其中具有代表性的2種方法。自動圖像分析系統通過神經網絡圖像識別技術完成形態特征的提取、映射和識別，具有檢測時間短、分類相關性好的特點[1-2]。快速流式細胞術是采用一步法標記抗體、免去細胞洗滌、軟件自動設門的外周血白細胞分類技術。本研究擬探討上述2種方法在白細胞減少性疾病中的價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2019年1—10月在上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院就診且白細胞計數為（0.5～2.0）×109/L的患者181例，其中急性髓系白血病（acute myelocytic leukemia，AML）（包括化療中）66例、急性淋巴細胞白血病（acute lymphocytic leukemia，ALL）（包括化療中）39例、骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndrome，MDS）25例、淋巴瘤（包括化療中）31例、慢性乙型肝炎20例。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑 FC500流式細胞儀及配套試劑，包括細胞分析用溶血劑（VersaLyse Solution）、細胞保存液（IOTest3）、流式細胞精密度質控微球（Flow-Check Pro Florospheres）和組合抗體含簇分化抗原（cluster of differentiation，CD）45、CD36、CD16、CD19、CD2和CD294均購自美國貝克曼庫爾特公司。SP-10自動推染片機（以下簡稱SP10）及配套試劑均購自日本Sysmex公司。CellaVision DM96自動圖像分析系統購自瑞典CellaVision公司。

1.2.2 檢測流程 采集患者靜脈全血2 mL，用乙二胺四乙酸二鉀抗凝，混勻后于2 h內完成檢測。隨機挑選20份低值白細胞標本分別用顯微鏡鏡檢法、自動圖像分析系統和快速流式細胞術進行白細胞分類計數并計時。使用SP-10進行推片、染色，每份標本制作至少2張血涂片，以滿足顯微鏡鏡檢及自動圖像分析系統白細胞分類計數要求。顯微鏡鏡檢法：每份標本由高年資技師人工顯微鏡鏡檢分類計數100個白細胞并記錄耗時與結果。自動圖像分析系統：記錄100個白細胞自動圖像分析系統預分類及自動圖像分析系統預分類+人工審核的耗時與結果。快速流式細胞術：預先將細胞保存液與細胞分析用溶血劑以1∶40的比例配制成裂解固定液。將10 μL組合抗體與100 μL抗凝血混勻，室溫避光靜置15 min，隨后加入1 mL裂解固定液，混勻后室溫避光靜置10 min，檢測前使用Flow-Check檢查儀器狀態，分類計數10000個有核細胞，儀器自動設門計算細胞百分比，根據需要適當調整設門位置，記錄操作耗時與檢測結果。選取白細胞計數在2.0×109/L左右、存在一定數量原始細胞的標本，依次應用上述方法連續檢測11次，去除第1次結果后計算后10次中性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞和原始細胞分類計數的精密度。

1.3 原始細胞陽性判定標準

顯微鏡鏡檢法和自動圖像分析系統預分類+人工審核原始細胞百分比≥1%時記為陽性。快速流式細胞術原始細胞百分比≥0.5%時記為陽性。

1.4 統計學方法

采用SPSS 17.0軟件進行統計分析。呈正態分布的數據以表示。呈非正態分布的數據以中位數（最小值，最大值）表示，組間比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗。采用Pearson相關分析評估各種方法間的相關性。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評估各種方法檢測原始細胞的性能。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 白細胞分類計數耗時比較

顯微鏡鏡檢法耗時最長，自動圖像分析系統預分類耗時最短，各組間差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 4種方法白細胞分類計數耗時比較 s

2.2 白細胞分類計數精密度比較

快速流式細胞術中性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞、原始細胞分類計數結果的離散度優于其他3種方法，顯微鏡鏡檢法分類計數結果的離散度最大。見表2。

2.3 原始細胞陽性符合率比較

對181例標本進行顯微鏡鏡檢，發現原始細胞陽性98例，陰性83例。顯微鏡鏡檢示原始細胞陽性的98例標本中，快速流式細胞術檢出原始細胞陽性93例（94.9%），假陰性5例；自動圖像分析系統預分類檢出原始細胞陽性53例（54.1%），假陰性45例；自動圖像分析系統預分類+人工審核檢出原始細胞陽性78例（79.6%），假陰性20例。見表3。

表2 4種方法白細胞分類計數結果 %，

表2 4種方法白細胞分類計數結果 %，

表3 3種方法原始細胞陽性符合率比較

2.4 3種方法原始細胞檢測結果與顯微鏡鏡檢法的相關性

快速流式細胞術和自動圖像分析系統預分類+人工審核原始細胞分類結果與顯微鏡鏡檢法的相關性較好（r值分別為0.937、0.990，P＜0.001），自動圖像分析系統預分類與顯微鏡鏡檢法的相關性較差（r=0.507，P＜0.001）。見表4。

表4 3種方法原始細胞檢測結果與顯微鏡鏡檢法的相關性比較

2.5 3種方法檢測原始細胞的性能

ROC曲線分析結果顯示，快速流式細胞術、自動圖像分析系統預分類+人工審核和自動圖像分析系統預分類檢測原始細胞的曲線下面積分別為0.97、0.90、0.63。自動圖像分析系統預分類檢測原始細胞的敏感性和特異性均最低，快速流式細胞術的敏感性最高，自動圖像分析系統預分類+人工審核的特異性最高（100.00%）。見表5、圖1。

表5 3種方法檢測原始細胞的性能比較

圖1 原始細胞檢測的ROC曲線

3 討論

顯微鏡鏡檢是白細胞分類計數的金標準，但其準確性受制片質量、觀察部位、檢驗人員水平等諸多因素影響[3-4]，檢測效率更是與白細胞計數密切相關。白血病患者使用的細胞毒性化療藥物往往會抑制骨髓生長，引起白細胞數量的下降和形態變化[5]，這些因素不同程度地增加了顯微鏡鏡檢的時間和難度。因此，理想的白細胞分類技術應在具備顯微鏡鏡檢優點的基礎上盡可能減少不足之處。

在臨床標本不斷攀升、人員工作量趨近飽和的背景下，提高檢測速度是確保標本周轉時間（turn-around time，TAT）的前提。本研究結果顯示，白細胞數量減少時，顯微鏡鏡檢法單次白細胞分類計數耗時約15 min，而快速流式細胞術由于通量高、速度快，中位耗時約5 min，約為顯微鏡鏡檢法的32%。自動圖像分析系統通過“城垛式”閱片的方式迅速定位細胞，提取特征后利用神經網絡判斷細胞類別，因此自動圖像分析系統預分類速度更快，中位時間僅為顯微鏡鏡檢法的22%。在預分類的基礎上進行人工審核需時約6 min，約為顯微鏡鏡檢法的42%，其中人員操作時間只需3 min左右，有效減輕了工作負擔。

提升白細胞分類計數精密度是保證檢驗質量的條件。本研究結果顯示，快速流式細胞術檢測中性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞、原始細胞的離散度優于自動圖像分析系統預分類、自動圖像分析系統預分類+人工審核和顯微鏡鏡檢法，主要原因在于快速流式細胞術檢測細胞的數量更多，閱片或掃描區域更大。快速流式細胞術單次檢測104個細胞，而顯微鏡鏡檢法或自動圖像分析系統由于以血涂片為載體，用于分類的白細胞數量僅為100～200個；此外，顯微鏡鏡檢法或自動圖像分析系統在白細胞分類計數時無法保證每人每次閱片或者儀器掃描的區域完全相同。因此，白細胞分類計數結果的離散度自然高于快速流式細胞術。

白血病治療過程中外周血原始細胞的清除率反映患者對藥物的敏感性，是指導臨床用藥、提示疾病預后的依據之一[6-9]。而計算清除率的前提是檢測方法檢出原始細胞的能力。本研究結果顯示，以顯微鏡鏡檢法為參考方法，原始細胞陽性符合率由高到低依次為快速流式細胞術（94.9%）、自動圖像分析系統預分類+人工審核（79.6%）和自動圖像分析系統預分類（54.1%）。快速流式細胞術對原始細胞的判斷基于細胞膜CD45的表達，受細胞形態變化干擾小，因此僅有5例標本假陰性和1例標本假陽性。假陰性標本來自AML化療患者，顯微鏡鏡檢見幼稚單核細胞，形態學上這類細胞與原始細胞意義相同[10]，在顯微鏡鏡檢時歸入原始細胞。但幼稚單核細胞CD45表達程度高于原始細胞，自動設門時歸為成熟單核細胞。假陽性標本來自多發性骨髓瘤患者，顯微鏡鏡檢可見大量漿細胞。由于組合抗體中沒有針對漿細胞的抗體，而散點圖中漿細胞CD45表達程度弱于其他正常細胞，設門時自動計入原始細胞，造成原始細胞比例假性升高。此類問題最好的解決策略是增加標記抗體種類或優化設門邏輯。國際血液學標準化委員會提出，使用8～10色的流式細胞術用于外周血白細胞分類，但上述方案目前仍在評估，進入臨床尚需時日[11-12]。自動圖像分析系統預分類有45例假陰性標本和21例假陽性標本。假陰性標本多來自ALL化療患者，原始淋巴細胞在藥物誘導下數量減少且形態變化，儀器將其歸入淋巴細胞、涂抹細胞或無法識別的細胞等。COVUT等[9]的研究結果顯示，自動圖像分析系統在預分類時原始淋巴細胞數量往往被嚴重低估，在未進行化療的標本中這些細胞多被計入成熟淋巴細胞。假陽性標本中誤分類為“原始細胞”的有反應性淋巴細胞、未成熟粒細胞、發生退化的淋巴細胞等。上述情況在人工審核后有所改善，儀器的錯誤分類得以糾正，因此假陰性標本和假陽性標本數明顯下降。

本研究結果顯示，即使白細胞減少，快速流式細胞術原始細胞檢測結果與顯微鏡鏡檢法（參考方法）仍有良好的相關性（r=0.937），與KAHNG等[13]的研究結果一致。但本研究得出的r值高于KAHNG等[13]的結果（r=0.8325），可能與研究對象的例數及參考方法計數的細胞數量不同有關。自動圖像分析系統預分類與顯微鏡檢法的相關性較差（r=0.507），但自動圖像分析系統預分類+人工審核與顯微鏡鏡檢法的r值可達0.990，這與人工審核后原始細胞陽性符合率的變化一致。

ROC曲線分析結果顯示，快速流式細胞術及自動圖像分析系統預分類+人工審核檢測原始細胞的曲線下面積分別為0.97和0.90，對標本中原始細胞的有無具有幾乎相同的區分能力。快速流式細胞術檢測原始細胞的敏感性更高，可達94.90%，這與流式細胞術相對更高數量級的細胞檢測數、特異性單克隆抗體的使用及設門邏輯有關[14]，但受抗體種類的制約。當細胞分化抗原表達上調或下降，組合抗體未包含識別某一類細胞的抗體時，結果會出現偏差。自動圖像分析系統預分類+人工審核的特異性可達100%，但敏感性不到80%，原因為儀器漏檢了對部分原始細胞比例為1%～2%。白細胞數量少，原始細胞比例過低，細胞分布不均以及檢測時的隨機誤差可能是造成這種現象的原因[15-16]。鑒于自動圖像分析系統有較快的檢測速度，適當增加自動圖像分析系統預分類的細胞數量可能是目前最有效的解決方式。EILERTSEN等[17]的研究結果顯示，自動圖像分析系統預分類的原始細胞檢測敏感性高于自動圖像分析系統預分類+人工審核，與本研究結果相反，推測該研究的技術人員誤將原始細胞辨認為其他細胞。部分原始細胞的染色質結構在儀器顯示屏上不易辨認[15]可能是分類錯誤的原因，提示當儀器對細胞的染色質結構顯示不清晰時，應結合顯微鏡進行觀察。

綜上所述，白細胞數量減少時快速流式細胞術檢測原始細胞精密度高、速度快、結果準確；自動圖像分析系統預分類+人工審核的方式檢測原始細胞高效、特異，同時可降低工作負擔。不同方法的合理組合可提高白細胞減少性疾病原始細胞檢測的敏感性、特異性及檢測效率，對疾病的診斷、治療和預后判斷具有重要意義。