蕓薹根腫菌蛋白磷酸酶組的鑒定及生物信息學分析

余方偉 王神云 張偉 王紅 于利 李建斌

摘要：由蛋白激酶和蛋白磷酸酶調控的蛋白質可逆磷酸化是一種重要的蛋白質翻譯后修飾，它在信號轉導、細胞周期、基因轉錄、代謝調控等過程中起到至關重要的作用。本研究以蕓薹根腫菌e3菌株的基因組為試驗數據來源，采用生物信息學方法對蕓薹根腫菌全基因組蛋白磷酸酶進行了鑒定和表達分析。 基于隱馬爾可夫模型（Hidden markov model，HMM）搜索與SMART分析相結合，本研究在蕓薹根腫菌基因組中共鑒定出54個蛋白磷酸酶基因。編碼的54個蛋白磷酸酶可以進一步被分成4類，包括10個磷酸化蛋白磷酸酶（PPP），21個金屬離子依賴型蛋白磷酸酶（PPM），19個酪氨酸蛋白磷酸酶（PTP），4個基于天冬氨酸的蛋白磷酸酶（APP）。這54個蛋白磷酸酶的相對分子質量為10 780～125 140，等電點為4.43～10.45。通過信號肽和跨膜結構域分析發現在這54個蛋白磷酸酶中，PBRA_007461存在信號肽，PBRA_003636、PBRA_004449、PBRA_004464、PBRA_005270、 PBRA_006854和PBRA_007201存在跨膜結構域。轉錄組分析結果表明這54個蛋白磷酸酶基因在不同時期差異表達，值得一提的是在休眠孢子萌發期和休眠孢子成熟期，金屬離子依賴型蛋白磷酸酶基因PBRA_001085的表達量最高，說明該磷酸酶在休眠孢子發育中起到重要作用。綜上所述，本研究可為蕓薹根腫菌蛋白磷酸酶功能研究和根腫病防治靶標選擇提供理論基礎。

關鍵詞：根腫病;蕓薹根腫菌;蛋白磷酸酶

中圖分類號：Q814文獻標識碼：A文章編號：1000-4440（2020）02-0318-07

Abstract：Reversible phosphorylation of proteins， regulated by protein kinases and protein phosphatases is an important post-translational modification， which plays a vital role in signal transduction， cell cycle， gene transcription and metabolic regulation. In this study， bioinformatics tools were used to analyze the protein sequences from Plasmodiophora brassicae e3 strain， and the identified protein phosphatase genes were further subjected to expression profiling analysis. Based on the combination of hidden markov model （HMM） search and SMART analysis， a total of 54 protein phosphatase genes were identified in the genome of P. brassicae. These 54 protein phosphatases could be further classified into four categories， including 10 phosphoprotein phosphatases （PPP）， 21 metal ion-dependent protein phosphatases （PPM）， 19 protein tyrosine phosphatases （PTP）， four aspartate-based protein phosphatases （APP）. The molecular weights of these 54 protein phosphatases ranged from 10 780 to 125 140， and the isoelectric points ranged from 4.43 to 10.45. The results of signal peptide and transmembrane domain analysis revealed that among 54 candidate protein phosphatases， PBRA_007461 had a signal peptide， and there were transmembrane domains in PBRA_003636， PBRA_004449， PBRA_004464， PBRA_005270， PBRA_006854 and PBRA_007201. Transcriptome analysis results showed that these 54 protein phosphatases genes were differentially expressed at different stages. Notably， the expression of the metal ion-dependent protein phosphatase gene PBRA_001085 was highest during the resting spore germination and the spore maturation period， indicating that it played an important role in resting spore development. In conclusion， this study can provide a theoretical basis for the characterization of protein phosphatases and development of novel strategies against clubroot.

Key words：clubroot;Plasmodiophora brassicae;protein phosphatase

由蕓薹根腫菌（Plasmodiophora brassicae Woronin）引起的根腫病對全世界十字花科作物的生產構成越來越大的威脅[1-3]。僅在中國，每年大約有3.20×106～4.00×106hm2的十字花科作物受到根腫病的影響，造成20%～30%的產量損失[3]。盡管選育抗病品種是控制根腫病最經濟有效的方法[4]，但新型致病小種的出現也極大地損害了抗病品種的推廣應用[5-7]。因此，根腫病防治新策略的研究迫在眉睫。

蛋白質可逆磷酸化是生物體內信號傳導的主要形式和重要的調控機制[8-10]。蛋白質磷酸化過程由蛋白激酶（PKs）控制。現有研究結果表明，蛋白質可以在9個氨基酸（酪氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、精氨酸、賴氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和組氨酸）位點上發生磷酸化[11]，但絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸磷酸化在真核細胞中占主導地位并發揮關鍵調控作用[12]。對2 244種人類蛋白質上6 600個磷酸化位點的蛋白質組學分析結果表明，磷酸化絲氨酸（pSer）、磷酸化蘇氨酸（pThr）和磷酸化酪氨酸（pTyr）分別占磷酸化氨基酸的86.4%、11.8%和1.8%[13]。對禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum） 2 902個磷酸化肽分析發現，pSer、pThr和pTyr分別占磷酸化氨基酸的87.0%，26.0%和2.4%[14]。在白色念珠菌中（Candida albicans），對2 896個蛋白質的15 906個特異磷酸化位點鑒定分析發現，pSer、pThr和pTyr分別占磷酸化氨基酸的80.01%，18.11%和1.81%[15] 。在黃曲霉（Aspergillus flavus）中，對293個磷酸化蛋白的598個磷酸化位點進行分析發現，pSer、pThr和pTyr分別占磷酸化氨基酸的81.1%，16.4%和2.5%[16] 。蛋白質去磷酸化過程由蛋白磷酸酶（PP）控制。根據蛋白質底物特異性、結構和催化機制不同，PP可分為2個主要的大家族：蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP）和絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶（PSP）。 PTP成員主要催化磷酸酪氨酸的去磷酸化，包括經典PTP，雙特異性磷酸酶（DSP），Cdc25型磷酸酶和低分子量磷酸酶[17]。 PSP包含3個主要家族：磷酸化蛋白磷酸酶（PPP），金屬依賴性蛋白磷酸酶（PPM）和基于天冬氨酸的蛋白磷酸酶（APP）[18]。已有的結果表明磷酸酶基因家族成員在不同物種中數目不同，且其生物學功能各異。如在構巢曲霉（Aspergillus nidulans）中已鑒定出28個PP，其中8個是正常生長或有絲分裂所必需的[19]。反向遺傳分析結果表明，禾谷鐮刀菌的磷酸酶參與菌絲生長、分生孢子形成、致病和產毒等過程[20-21]。

因為PP的功能多樣性和重要性，本研究擬采用生物信息學分析方法挖掘鑒定蕓薹根腫菌的蛋白磷酸酶，對其理化性質、跨膜結構域、信號肽進行分析，并通過轉錄組學分析這些磷酸酶在不同階段的表達變化，為后續蕓薹根腫菌磷酸酶的功能研究及根腫病新的防治策略研究提供借鑒。

1材料與方法

1.1蕓薹根腫菌基因組序列

以蕓薹根腫菌e3菌株的基因組為起始序列，進行后續生物信息學分析，序列下載自公共數據庫NCBI（ftp：//ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCA/001/049/375/GCA_001049375.1_pbe3.h15） 。

1.2生物信息學分析

從Pfam數據庫（http：//pfam.xfam.org/）中下載pfam文件（表1），利用HMMER 3.0 軟件[22]搜索蕓薹根腫菌的蛋白質氨基酸序列。用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）對獲得的氨基酸序列進行結構域分析，剔除不含磷酸酶催化結構域的氨基酸序列，再進一步剔除不完整的氨基酸序列，最后剩下的序列即為候選蛋白磷酸酶氨基酸序列。采用SignalP 4.0[23] 和TMHMM 2.0 [24]分別對候選蛋白質的信號肽和跨膜結構域進行分析。

1.3表達量分析

蕓薹根腫菌的轉錄組數據源自Schwelm等[25]的報道：將-20 ℃保存的分離純化后的休眠孢子置于4 ℃解凍48 h后，再轉移到含有400 ng/ml特美汀的滅菌水中室溫孵育24 h，以此樣品提取RNA進行轉錄組學分析，獲得的數據即為休眠孢子萌發期數據;蕓薹根腫菌侵染油菜（Brassica napus）栽培種Westar 35 d后，從油菜病根中分離原生質團，提取原生質團的RNA進行轉錄組學分析，獲得的數據即為原生質團時期數據;從蕓薹根腫菌侵染35 d后的白菜（B.rapa）栽培種 Granaat病根中分離休眠孢子，以此休眠孢子提取RNA進行轉錄組學分析，獲得的數據為休眠孢子成熟期數據;白菜栽培種Granaat、油菜栽培種Dc119 Giant rape和結球甘藍（B. oleracea var. capitata） Jersey Queen接種蕓薹根腫菌35 d后，分別取病根進行表面消毒后提取總RNA進行轉錄組學分析，以此獲得的數據即為不同寄主的數據來源。根據Trapnell等[26]報道的方法將數據換算成FPKM（Fragments per kilobase of transcript per million mapped reads）。蛋白磷酸酶基因的表達量換算成Log2（FPKM+1）值后，利用R語言中的pheatmap包繪制熱圖。

2結果與分析

2.1蕓薹根腫菌蛋白磷酸酶的鑒定

以Pfam文件為種子序列搜索蕓薹根腫菌的蛋白質庫，再結合SMART結構域分析，本研究從蕓薹根腫菌基因組中鑒定到了57個蛋白磷酸酶基因，經過序列分析發現，其中3個蛋白磷酸酶基因（PBRA_000895、PBRA_000081 和PBRA_000766）的序列不完整，剔除以上3個基因后，最終選擇剩余的54個蛋白磷酸酶基因（表2）。

2.2蕓薹根腫菌蛋白磷酸酶理化特性分析

根據結構域預測分析結果，這54個蛋白磷酸酶可以進一步被分成4類，包括10個磷酸化蛋白磷酸酶，21個金屬離子依賴型蛋白磷酸酶，19個酪氨酸蛋白磷酸酶， 4 個基于天冬氨酸的蛋白磷酸酶（表2）。如表2所示，這54個蛋白磷酸酶的氨基酸殘基數目為92～1 111 aa，其中氨基酸殘基數目最少的為酪氨酸磷酸酶PBRA_008356，氨基酸殘基數目最多的為磷酸化蛋白磷酸酶PBRA_004449。這54個蛋白磷酸酶的相對分子質量為10 780 ～125 140，其中相對分子質量最低的為酪氨酸磷酸酶PBRA_008356，相對分子質量最大的為磷酸化蛋白磷酸酶PBRA_004449。 這54個蛋白磷酸酶的理論等電點為4.43～10.45，其中理論等電點最低的為金屬離子依賴性磷酸酶PBRA_008437，理論等電點最高的為酪氨酸蛋白磷酸酶PBRA_009167。

2.3蕓薹根腫菌蛋白磷酸酶信號肽和跨膜結構域的預測分析

對這54個蛋白磷酸酶進行信號肽分析發現，PBRA_007461存在信號肽，且在第19～20位氨基酸殘基處存在信號肽切割位點，說明該蛋白質是一個潛在外泌蛋白質。通過TMHMM2.0分析發現，PBRA_003636、PBRA_004449、PBRA_004464、PBRA_005270、 PBRA_006854和PBRA_007201存在跨膜結構域（PBRA_004449有5個跨膜結構域，其他均為1個），說明這些磷酸酶可能是膜定位。

2.4蕓薹根腫菌蛋白磷酸酶基因在不同階段表達動態變化

通過轉錄組分析對這54個蛋白磷酸酶基因在不同時期的表達進行分析。如圖1所示，有21個磷酸酶基因（PBRA_005571、PBRA_006854、 PBRA_007271、 PBRA_005957、 PBRA_005771、 PBRA_002157、PBRA_000495、PBRA_003208、PBRA_002428、PBRA_000135、PBRA_003636、 PBRA_003461、PBRA_002692、PBRA_008437、PBRA_006030、PBRA_007543、PBRA_001085、 PBRA_000278、 PBRA_002029、 PBRA_004449、 PBRA_003042）在各個階段的表達量均較高，8個磷酸酶基因（PBRA_008821、PBRA_007906、 PBRA_000995、 PBRA_001432、 PBRA_005270、PBRA_008356、PBRA_005841、 PBRA_009167）在各個階段的表達量均較低，其余基因在不同階段差異表達。在孢子萌發階段，表達量最高的磷酸酶基因為PBRA_001085，在原生質團階段，表達量最高的磷酸酶基因為PBRA_000278，在孢子成熟階段，表達量最高的磷酸酶基因為PBRA_001085。

3討論

由蕓薹根腫菌導致的根腫病嚴重威脅十字花科作物的可持續生產，這種病也被稱為植物的“癌癥”。蕓薹根腫菌是細胞內活體營養型病原物，因為其無法在人工合成培養基上生長，缺乏穩定的遺傳轉化體系，因此常規的反向遺傳操作難以在蕓薹根腫菌中得到應用。隨著高通量測序技術的快速發展，采用生物信息學方法進行蕓薹根腫菌基因挖掘和分析已成為現實。本研究通過生物信息學分析方法從蕓薹根腫菌基因組中鑒定到54個蛋白磷酸酶基因。目前研究結果表明，人和擬南芥（Arabidopsis thaliana）中分別存在148和150個蛋白磷酸酶基因[27]，水稻（Oryza sativa）中有132個蛋白磷酸酶基因[28]，玉米（Zea mays）中有159個蛋白磷酸酶基因[29]，原生生物瘧原蟲（Plasmodium falciparum）中有67個蛋白磷酸酶基因[30]。蕓薹根腫菌在分類上屬于原生生物，因此其蛋白磷酸酶基因的數目與同為原生生物的惡性瘧原蟲較為接近。越來越多的研究結果表明蛋白磷酸酶在病原物生長和致病等生物進程中起到重要作用。禾谷鐮刀菌的磷酸酶在菌絲生長、細胞分裂、分生孢子形成、致病性和外界脅迫響應等過程中發揮重要作用[20-21]。核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）的鈣調磷酸酶在其菌核發育和致病性中起到重要作用[31]。弓形蟲（Toxoplasma gondii）可以分泌蛋白磷酸酶2c來操縱寄主細胞[32]。在這54個蛋白磷酸酶中，PBRA_007461是一個潛在的外泌蛋白，它也可能通過與弓形蟲相類似的機理來發揮效應因子的功能，當然這需要后續更多的試驗證據來佐證。蛋白磷酸酶在病原物生長和侵染中扮演著重要的角色，這也為病害的防治提供了潛在的靶標[33]。有研究結果表明，MAPKK激酶抑制劑 U0126可以有效降低根腫病的發病程度[34]。受此啟發，挖掘蕓薹根腫菌生長和致病關鍵蛋白磷酸酶的特異性抑制劑可望為根腫病防治提供新的思路和切入點。

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（責任編輯：陳海霞）