江蘇地區奶牛場blaNDM陽性大腸桿菌的分子流行病學

王警 張雪寒 郭蕓蕓 張碧成 吳慶俠 何孔旺

摘要：為了調查江蘇地區奶牛場大腸桿菌中blaNDM基因的分子流行病學特征。從江蘇部分地區3個奶牛場采集樣品134份，使用PCR和測序的方法篩選blaNDM陽性大腸桿菌，同時對其進行超廣譜β-內酰胺酶類基因的檢測，采用藥敏試驗檢測blaNDM陽性大腸桿菌對19種常用抗生素的敏感性，通過多位點序列分型（MLST）和脈沖場凝膠電泳（PFGE）對攜帶NDM基因的大腸桿菌進行親緣關系分析，通過質粒結合試驗驗證blaNDM基因的可轉移性。結果顯示，從134份奶牛場樣品中共分離15株blaNDM陽性大腸桿菌，包括NDM-1和NDM-5 2種變體。15株blaNDM陽性大腸桿菌對多種抗生素均呈現不同程度的耐藥，奶牛場15株blaNDM陽性大腸桿菌包括7種ST型，分別是ST410、ST846、ST206、ST101、ST1642、ST3076、ST1626，同一種ST型在糞便樣品和環境樣品中同時存在，表明相同ST型blaNDM陽性大腸桿菌可在動物與環境間相互傳播。PFGE試驗結果表明，15株blaNDM陽性大腸桿菌可以分為11個簇，同一樣品的分離株傾向于相同的簇，在比較小的范圍內存在PFGE圖譜相同的現象;對15株菌株的結合子進行blaNDM基因的轉移性試驗結果表明，15株大腸桿菌的blaNDM耐藥基因均通過質粒結合轉移至受體菌J53。表明，blaNDM陽性大腸桿菌在江蘇省部分地區奶牛場中流行相對較為嚴重，存在多重耐藥現象，推測blaNDM基因主要通過質粒結合轉移的方式進行水平傳播，這為食品源耐藥菌的監測及風險評估提供了依據。

關鍵詞：NDM耐藥基因;大腸桿菌;多位點序列分型;藥敏試驗

中圖分類號：S852.61+2文獻標識碼：A文章編號：1000-4440（2020）02-0391-07

Abstract：To investigate the epidemiology and molecular characteristics of blaNDM gene in Escherichia coli from dairy farms in Jiangsu province， a total of 134 samples were collected from three dairy farms in Jiangsu province. The blaNDM-positive E. coli was screened using PCR and sequencing， and the extended-spectrum β-lactamase gene was detected. The antimicrobial susceptibility testing was used to detect the sensitivity of blaNDM-positive E. coli to 19 commonly used antibiotics. The genetic relationship of E. coli carrying NDM gene was analyzed by multi-locus sequence typing （MLST） and pulsed-field gel electrophoresis （PFGE）. The transferability of blaNDM gene was verified by conjugation experiments. The results showed that fifteen strains of blaNDM-positive E. coli were isolated from 134 dairy samples， including NDM-1 and NDM-5. All fifteen strains of blaNDM-positive E. coli exhibited different resistance to multiple antimicrobials and belonged to seven STs， namely ST410， ST846， ST206， ST101， ST1642， ST3076， ST1626. The same ST was involved in both fecal and environmental samples， indicating that blaNDM-positive E. coli with the same type of ST could be transmitted from animals to environment. The results of PFGE showed that fifteen strains of blaNDM-positive E. coli could be divided into 11 clusters， isolates of the same sample tended to have the same PFGE cluster， and the same PFGE pattern existed in a relatively small range. The blaNDM gene of fifteen strains of E. coli was transferred to receptor bacterium J53 by binding with plasmids. The blaNDM-positive E. coli is relatively more prevalent in dairy farms in Jiangsu， and there is multi-drug resistance. The blaNDM gene is mainly transmitted by means of combined transfer， which provides a basis for monitoring and risk assessment of drug-resistant bacteris.

Key words：drug-resistant gene NDM;Escherichia coli;multi-locus sequence typing（MLST）;antimicrobial susceptibility testing

新德里金屬β-內酰胺酶（NDM）能夠水解除單環β-內酰胺酶類外的所有金屬內酰胺酶（MBL）[1-2]，包括碳青霉烯酶。碳青霉烯酶是治療許多革蘭氏陰性細菌引起的嚴重感染的主要抗微生物劑[3-4]，是在臨床治療中的最后一道防線。目前臨床上無法獲得NDM酶水解內酰胺類藥物的抑制劑，包括克拉維酸，他唑巴坦和舒巴坦。NDM-1最初是在2008年從印度新德里住院的瑞典患者中分離出的肺炎克雷伯菌中鑒定出來的，此后陸續在腸桿菌科、不動桿菌屬和假單胞菌的各種物種中發現NDM-1，并已鑒定出24種NDM變體，其中肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌是blaNDM基因主要攜帶者，對于大腸桿菌，其ST410、ST167、ST617是最流行的[5]。NDM陽性菌株已在世界范圍內傳播并被發現，在印度次大陸，中東和巴爾干各島地區的流行率最高，對臨床管理和公共衛生構成了重大挑戰[6-7]。

不僅在醫院，這種攜帶blaNDM基因的菌株在社區和環境中也有發現。近些年來，已在食品源動物、伴侶動物、野生動物中發現NDM陽性菌[8]。2017年Wang等[9]對肉雞產業鏈中blaNDM基因進行流行病學調查研究，發現NDM陽性大腸桿菌來源于商品雞場，并可在商品雞場的雞、狗、人、家燕和蒼蠅等不同生物間傳播。2019年Liu等[10]在鵝場的水樣中發現了ST48型的攜帶blaNDM-5的大腸桿菌，這是第一次在水禽環境中發現NDM陽性大腸桿菌。2017年He等[11]首次在江蘇省奶牛糞便和生牛乳中發現攜帶blaNDM-5的肺炎克雷伯菌。在國外，2013年Ghatak等[12]在牛奶樣品中發現了攜帶有blaNDM的大腸桿菌，同年歐洲科學家分別在野生鳥類和寵物狗中分離得到NDM陽性沙門氏菌和NDM陽性大腸桿菌[13-14]。這些都表明伴侶動物和食品動物已成為攜帶blaNDM 的細菌儲庫，對公共衛生安全造成潛在威脅。

對于NDM陽性細菌來說，優勢克隆菌株的擴散傳播或質粒在動物、動物性食品和人之間進行快速傳播是導致NDM基因流行的主要分子機制。中國作為食品動物大國，加強對食品源動物中碳青霉烯酶耐藥基因NDM流行狀況的監測顯的尤為重要，對國家控制細菌耐藥性具有重要的意義。本研究從江蘇部分地區奶牛場中采集樣品，分離碳青霉烯酶耐藥大腸桿菌，對blaNDM耐藥基因在食品動物源大腸桿菌中的流行狀況和傳播特征進行了調查研究。

1材料與方法

1.1樣品和菌株來源

2018年6月從江蘇淮安2個奶牛養殖場采集樣品104份，包括糞便樣品和環境樣品，2018年5月在徐州某奶牛養殖場采集糞便樣品和環境樣品共30份，其中環境樣品包括皮膚擦拭子和環境水樣品。3個奶牛養殖場均使用過β-內酰胺酶制劑來處理牛乳腺炎，例如阿莫西林和頭孢噻呋。大腸埃希菌ATCC25922和J53均由江蘇省農業科學院農產品質量安全與營養研究所何濤博士提供。

1.2主要試劑及培養基

頭孢噻呋、頭孢他啶、亞胺培南、美羅培南和氨曲南均購自北京索萊寶科技有限公司，EC肉湯、麥康凱培養基、MH瓊脂以及 MH肉湯購自青島海博生物技術有限公司，PCRmix購自廣州東盛生物技術有限公司，限制性核酸內切酶XbaⅠ購自大連寶生物工程（TaKaRa）有限公司，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.3blaNDM陽性大腸桿菌的分離與鑒定

將糞便樣品和環境擦拭子用PBS處理后，以1%的比例加入到100 ml含新生霉素的EC肉湯中37～40 ℃增菌8～12 h，然后在含有1 μg/ml美羅培南的麥康凱瓊脂板上劃線，37 ℃培養16～24 h，挑取平板上的紅色單菌落用16S rRNA引物和微生物鑒定儀（Aris2×）來鑒定菌屬，煮沸法制取模板。鑒定成功的大腸桿菌用PCR方法擴增blaNDM基因，NDM特異性引物按照參考文獻[15]合成，對擴增的陽性NDM進行測序，測序結果使用DNAMAN軟件進行比對確定NDM變體。

1.4耐藥基因的檢測

對攜帶有blaNDM基因的大腸桿菌進行其他ESBL類基因的檢測，引物按參考文獻[16]合成，分別檢測了blaSHV、blaTEM、blaCTX-M-1、blaCTX-M-2、blaCTX-M-9、blaCTX-M-25、blaPER-1、blaPER-2、blaVEB、blaGES、blaKPC、blaOXA-2-group、blaOXA-10-group。

1.5毒力基因的檢測

對攜帶有blaNDM基因的大腸桿菌進行相關毒力基因的檢測，三重PCR檢測stx1、stx2、hly基因，二重PCR檢測stx2v、eae基因，引物由本實驗室保存。

1.6藥敏試驗

按照美國臨床試驗室標準委員會CLSI（2013）推薦的瓊脂稀釋法測定大腸桿菌對臨床感染常用的抗感染藥物β-內酰胺酶類藥物（頭孢他啶、頭抱噻呋、美羅培南、亞胺培南和氨曲南）以及四環素、氨基酸糖苷類藥物（慶大霉素）、氟喹諾酮類（環丙沙星）等幾類藥物的敏感性。大腸埃希菌ATCC25922作為質控菌株，同時設MH肉湯為陰性對照。每株菌株做2個重復。操作步驟及結果判定按照標準藥敏實驗標準進行。

1.7多位點序列分型（MLST）

本研究對15株blaNDM陽性大腸桿菌進行MLST分型，7對管家基因引物[17]詳見表1，PCR擴增后進行瓊脂糖凝膠電泳，再送南京思普金公司進行測序。把一代測序的結果參照E.coli MLST的數據庫（https：//pubmlst.org/bigsdb？db=pubmlst_escherichia_seqdef）進行分型。

1.8脈沖場凝膠電泳試驗（PFGE）

參照美國CDC（Centers for disease control and prevention ）Pusle Net大腸桿菌標準PFGE操作規程，對攜帶有blaNDM基因的大腸桿菌進行PFGE分型。

1.9質粒結合試驗

使用膜接合轉移的方法對blaNDM基因的傳播方式進行驗證，分別以攜帶blaNDM基因大腸桿菌和J53作供體菌和受體菌，用含 1 mg/L的美羅培南和100 mg/L的疊氮化鈉的麥康凱平板篩選攜帶blaNDM基因陽性接合子，通過PCR方法驗證結合子blaNDM基因是否被成功結合轉移。

2結果

2.1NDM陽性大腸桿菌的分離與鑒定

2018年5月至6月在江蘇省淮安市和徐州市奶牛場134份樣品中共分離出15株blaNDM陽性大腸桿菌，經測序，并在DNAMAN上與24種NDM變體比對，發現包括NDM-1和NDM-5 2種變體（13株NDM-1，2株NDM-5），其中有5份來自環境樣品，10份來自糞便樣品。blaNDM樣品陽性率達7.23%（9/134），blaNDM陽性大腸桿菌的陽性率為 25.00%（15/60）。

2.2耐藥基因檢測結果統計

對15株blaNDM陽性大腸桿菌進行13種ESBL類基因的檢測，結果發現所有blaNDM陽性大腸桿菌攜帶一種或多種ESBL類基因，有1株從糞便樣品中分出的菌株同時攜帶NDM基因和多黏菌素耐藥基因mcr-1，由表2可知，環境樣品比糞便樣品含有ESBL類基因種類多。

2.3藥敏試驗

由圖1可看出，15株blaNDM陽性大腸桿菌對頭孢類（頭孢噻呋、頭孢他啶、頭孢唑啉）、四環素、氨芐西林都呈現100%的耐藥率，對氨曲南的耐藥率為0;15株菌對β-內酰胺酶類藥物美羅培南和亞胺培南的耐藥率分別為33.3%（5/15）和60%（9/15），對亞胺培南的耐藥率高于美羅培南;對氨基酸糖苷類藥物慶大霉素、妥布霉素和阿米卡星的耐藥率分別為53.3%（8/15）、33.3%（5/15）和6.7%（1/15）;對四環素類抗生素米諾環素的耐藥率達66.7%（10/15）;對喹諾酮類藥物環丙沙星和左氟沙星的耐藥率分別為60%（9/15）和33.3%（5/15）。

2.4多位點序列分型結果

通過多位點序列分型將15株blaNDM陽性大腸桿菌共分成7種ST型，包括ST206（2株）、ST846（4株）、ST410（1株）、ST1626（1株）、ST101（1株）、ST3076（1株）、ST1642（1株），以ST206和ST846較為流行（表3）。

2.5PFGE分型結果

如圖2所示，將15株blaNDM陽性大腸桿菌使用XbaⅠ酶進行PFGE分型，根據PFGE聚類結果，15株大腸桿菌可以分為11個簇，菌株1-28-139和菌株1-28-144具有相同的PFGE型別。菌株M3-1、M3-21和菌株M3-27具有相同的PFGE型別。菌株M1-41和菌株1-5-106具有相同的PFGE型別。其他8個型別分別只包含1株菌株。同一樣品的分離株傾向于相同的PFGE型別，在小范圍內存在相同的PFGE圖譜。

2.6質粒結合試驗

通過PCR方法對結合子進行blaNDM基因的驗證，15株大腸桿菌的blaNDM耐藥基因全部結合轉移至大腸桿菌J53中。這表明NDM耐藥基因可能會在不同的ST型大腸桿菌中以質粒轉移的方式進行傳播擴散。

3討論

本研究對江蘇省部分地區奶牛場的blaNDM耐藥基因的流行狀況及其傳播規律進行了研究。本研究從3個不同的奶牛場共采集樣品134份，其中blaNDM樣品陽性率達7.23%（9/134），blaNDM陽性大腸桿菌的陽性率25.00%（15/60），主要流行NDM-1和NDM-5 2種變體，在糞便樣品和環境樣品中均檢測到這2種變體的存在，表明blaNDM基因可能在動物體與環境間相互傳播，并存在從動物向人群擴散的風險。blaNDM-5陽性大腸桿菌相比blaNDM-1陽性大腸桿菌對以美羅培南為代表的碳青霉烯酶類抗生素，MIC高出14倍，推測NDM-5變體的酶活性高于NDM-1，可誘導菌株產生更強的耐藥能力;同時發現在環境樣品分離的菌株中攜帶有比較多種類的β-內酰胺酶基因。

碳青霉烯酶類藥物作為治療腸桿菌科細菌感染效果最好的抗菌藥物之一，治療效果都好于三、四代頭孢[18]，從本研究結果看，blaNDM陽性大腸桿菌除對單環β-內酰胺酶類抗生素氨曲南耐藥率為0外，幾乎對所有的碳青霉烯酶類抗生素都表現為不同水平的耐藥性，對頭孢類藥物已達到比較高的耐藥水平，對亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別達60.0%和33.3%，這與報道一致[19]。不僅如此，15株blaNDM陽性大腸桿菌對氨基酸糖苷類藥物、四環素類抗生素、喹諾酮類藥物都有不同水平的耐藥性;作為在獸醫臨床上使用率較高的藥物，本研究中15種blaNDM陽性大腸桿菌對慶大霉素和環丙沙星的耐藥率分別為53.3%和60.0%，這可能跟牛場的飼養管理有關，3個奶牛養殖場的養殖方式均是農戶散養，飼養管理水平比較落后，使得奶牛源大腸桿菌存在多重耐藥性，這也更有利于blaNDM基因從動物擴散到環境。

15株blaNDM陽性大腸桿菌共分成7種ST型，包括ST410、ST206、ST846、ST1626、ST101、ST3076、ST1642，奶牛場以ST206和ST846較為流行。除ST410外，其余都鮮少在奶牛中報道，只在人醫臨床中有報道。不同ST型對各種藥物的最小抑菌濃度無明顯差異，但當攜帶相同blaNDM基因時，大腸桿菌ST206對美羅培南MIC值比大腸桿菌ST846高出4倍。15株blaNDM陽性大腸桿菌使用XbaⅠ酶進行PFGE分型，根據PFGE聚類結果，15株大腸桿菌可以分為11個簇，小范圍內存在相同的PFGE圖譜[20-21]。從質粒結合轉移試驗結果中看出，15株大腸桿菌的blaNDM耐藥基因可全部結合轉移至大腸桿菌J53中，推測NDM耐藥基因可在不同的ST型中以質粒轉移的方式進行傳播，為確定NDM耐藥基因位于哪種質粒以哪種方式進行的傳播，后續需要做S1-PFGE和Southernblot進行驗證。

近年來，隨著抗菌藥物在人醫臨床及動物養殖中的廣泛使用，多重耐藥現象普遍存在。2017年世界經濟全球風險報告指出，病菌對抗生素的耐藥性己經成為人類健康的最大威脅之一，同時也給環境微生態平衡以及養殖產業的健康發展帶來了巨大損害[22]。本研究通過在江蘇部分地區奶牛場采集134份樣品，分離到15株碳青霉烯酶耐藥大腸桿菌，對blaNDM耐藥基因在奶牛場的流行狀況和傳播特征進行了調查研究，為食品動物源blaNDM陽性大腸桿菌的流行病學調查研究提供依據，加強了獸醫臨床動物中blaNDM基因的流行監測，對控制耐藥性的擴散具有重要意義。

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（責任編輯：陳海霞）