兔出血癥病毒2型的分離鑒定與序列分析

魏后軍 胡波 范志宇 宋艷華 仇汝龍 陳萌萌 薛家賓 王芳

摘要：兔出血癥（Rabbit hemorrhagic disease， RHD）是由兔出血癥病毒（Rabbit hemorrhagic disease virus， RHDV）引起的一種具有高度傳染性、急性致死性兔病。兔出血癥病毒2型（RHDV2）引起的RHD主要在歐洲流行，病兔的死亡率高達(dá)90%，而用經(jīng)典RHDV毒株制備的疫苗幾乎不能預(yù)防家兔感染RHDV2，從而給世界養(yǎng)兔業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。2020年4月，中國四川省某兔場首次發(fā)生由疑似RHDV2引起的RHD，筆者所在實(shí)驗(yàn)室通過紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)（Hemagglutination， HA）、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Reverse transcription-polymerase chain reaction， RT-PCR）擴(kuò)增、vp60基因序列分析和病毒復(fù)制試驗(yàn)，對采集的病死家兔肝臟樣本進(jìn)行病原鑒定。HA結(jié)果顯示，部分病死家兔的肝臟樣本不能引起血凝現(xiàn)象;RT-PCR結(jié)果顯示，樣品中出現(xiàn)了RHDV2的特異性條帶。對新發(fā)現(xiàn)毒株cDNA的RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，所擴(kuò)增vp60基因核苷酸序列與經(jīng)典RHDV vp60基因核苷酸序列的一致性為77.5%～80.1%，與RHDV2 vp60基因核苷酸序列的一致性為93.6%～96.1%，并且與RHDV2處于同一個進(jìn)化分支。病毒復(fù)制試驗(yàn)結(jié)果顯示，用病死家兔肝臟組織與磷酸緩沖鹽溶液（Phosphate buffer saline， PBS）按1 g∶10 ml混合后制成的懸液分別人工感染5只非免疫25日齡未斷奶仔兔和5只2月齡兔，在24～48 h全部死亡。基于以上試驗(yàn)結(jié)果，確定本研究新發(fā)現(xiàn)的RHDV毒株為RHDV2，并將其命名為SC2020，這是在中國首次發(fā)現(xiàn)RHDV2毒株，應(yīng)引起高度重視。

關(guān)鍵詞：兔出血癥;兔出血癥病毒2型（RHDV2）;vp60基因;鑒定;序列分析

中圖分類號：S855.3文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1000-4440（2020）02-0404-06

Abstract：Rabbit hemorrhagic disease （RHD） is a highly contagious and acute fatal disease caused by rabbit hemorrhagic disease virus （RHDV）. RHL caused by rabbit hemorrhagic disease virus type 2 （RHDV2） is mainly prevalent in Europe， and the mortality rate is as high as 90%. Rabbits can hardly be protected from infecting RHDV2 by classical RHDV vaccine， resulting in huge economic loss to world rabbit-raising industry. In April 2020， suspected RHDV2-induced RHD cases were found in a rabbitry of Sichuan province， China. Hemagglutination（HA） test， reverse transcription-polymerase chain reaction （RT-PCR）， vp60 gene sequence analysis and virus replication experiment were conducted to identify the pathogen in the collected livers of dead rabbits in our lab. The results of HA showed that the liver samples of some dead rabbits could not induce hemagglutination. In addition， specific bands of RHDV2 were detected by RT-PCR in the samples. Further analysis on RT-PCR product of newly discovered strain indicated that the nucleotide sequence of amplified vp60 gene shared 77.5%-80.1% and 93.6%-96.1% nucleotide sequence consistency with classic RHDV vp60 gene and RHDV2 vp60 gene， respectively. The amplified segment and RHDV2 were on the same branch of the evolutionary tree. The results of virus replication showed that five unweaned rabbits （25-day-old） and five rabbits （two-month-old） died in 24 h to 48 h after being infected with suspension of 10 ml phosphate buffer saline （PBS） versus 1 g liver tissues from dead rabbits. These results indicated that the newly discovered RHDV strain was RHDV2， and it was named as SC2020. This is the first RHDV2 strain detected in China， and it should be carefully monitored.

Key words：rabbit hemorrhagic disease;rabbit hemorrhagic disease virus type 2（RHDV2）;vp60 gene;identification;sequence analysis

兔出血癥（Rabbit hemorrhagic disease，RHD）是由兔出血癥病毒（Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV）引起的一種急性、高傳染性、高致死性疾病。經(jīng)典的RHDV只感染家兔，且易感染2月齡以上的家兔，染病后家兔的病死率達(dá)90%，常于感染后48～72 h死亡，死亡家兔具有呼吸系統(tǒng)和肝、脾、腎、心等實(shí)質(zhì)臟器瘀血、腫大和出血等特征[1];未斷奶仔兔不易感。該病于1984年首先在中國被報道，隨后迅速在全球大部分地區(qū)流行，同時RHDV也發(fā)生了遺傳變異。從系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系上看，RHDV可以分為G1～G6這6個基因型（GI.1），中國的流行毒株主要為G2、G6型[2-3]。2010年，在法國首次發(fā)現(xiàn)了RHDV的新毒株，研究者將其命名為RHDV2[4]。目前的研究發(fā)現(xiàn)，RHDV2對不同日齡的家兔均易感，家兔感染后的病死率可達(dá)90%。RHDV2與經(jīng)典RHDV毒株G1～G6型感染家兔致死的典型癥狀相似，但在遺傳特性及抗原性上有很大差異，并且用經(jīng)典毒株制備的疫苗不能有效避免家兔感染RHDV2[5]。目前，RHDV2已在歐洲擴(kuò)散，在亞速爾群島和澳大利亞也有相關(guān)報道[6-7]。中國肉兔配套系100%依賴進(jìn)口，主要進(jìn)口國為法國，中國同時是世界上最大的兔肉出口國，與歐洲之間在兔行業(yè)上的貿(mào)易往來密切。因此可見，RHDV2對中國養(yǎng)兔業(yè)的潛在威脅極大。

2020年4月1日，四川某兔場出現(xiàn)患病家兔的急性死亡病例，死亡家兔的臨床癥狀和病理變化與兔出血癥十分相似。2020年4月2日至4月5日，患病家兔的死亡數(shù)量明顯增多，且各日齡階段的家兔包括未斷奶的仔兔都有死亡發(fā)生。據(jù)了解，該兔場共有約300只母兔、1 500只商品兔，發(fā)病前已對家兔注射兔病毒性出血癥、多殺性巴氏桿菌病二聯(lián)滅活疫苗，發(fā)病后第5 d緊急注射上述二聯(lián)滅活疫苗，但效果不明顯，兔死亡率約為73.3%，且病死家兔均出現(xiàn)RHD的典型臨床癥狀。根據(jù)RHDV2可引起低齡幼兔死亡，且經(jīng)典RHDV組織滅活疫苗不能有效抵抗RHDV2感染的特征，初步推測該兔病的病原為RHDV2。經(jīng)紅細(xì)胞凝集（Hemagglutination， HA）試驗(yàn)、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Reverse transcription-polymerase chain reaction， RT-PCR）分析、序列測定及病毒復(fù)制試驗(yàn)，確定該病原為RHDV2，這是在中國首次發(fā)現(xiàn)的RHDV2毒株。

1材料與方法

1.1主要試驗(yàn)材料

病料樣品來源為四川省某兔場的3只病死家兔（編號為樣品1、樣品2、樣品3）;RHDV皖阜株、RHDV2 vp60基因構(gòu)建的重組質(zhì)粒pMD19-T-vp60-2由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存;陰性無特定病原體（Specific pathogen free， SPF）兔肝臟由邳州市東方養(yǎng)殖有限公司提供。

1.2紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)

參照中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（NY/T 572—2016《兔病毒性出血病血凝和血凝抑制試驗(yàn)方法》），分別取3只病死家兔的少許肝臟組織，置于載玻片上剪碎后滴加用磷酸緩沖鹽溶液（Phosphate buffer saline， PBS）配制的體積分?jǐn)?shù)為1%的人“O”型紅細(xì)胞，同時設(shè)SPF兔肝臟組織為陰性對照，設(shè)RHDV皖阜株肝臟組織為陽性對照，于4 ℃放置5 min。若肝臟組織中有兔出血癥病毒，肉眼可觀察到血凝現(xiàn)象。

1.3病毒RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

將家兔肝臟組織樣品與焦碳酸二乙酯（Diethyl pyrocarbonate， DEPC）水溶液按1∶10（質(zhì)量體積比）混合后研磨成懸液，10 000 r/min離心15 min，取上清液按照TRIzol法提取RNA;利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得病毒cDNA，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4病毒cDNA的PCR鑒定

參照筆者所在實(shí)驗(yàn)室建立的檢測經(jīng)典RHDV[8]和鑒別經(jīng)典RHDV與RHDV2的RT-PCR方法，以及世界動物衛(wèi)生組織（Office International Des Epizooties，OIE）推薦的用于檢測RHDV2[9]的RT-PCR方法中的引物（由南京擎科生物科技有限公司合成），以cDNA為模板，采用高保真的Golden Star T6 Super PCR MIX進(jìn)行家兔出血癥病毒vp60基因片段的擴(kuò)增。用筆者所在實(shí)驗(yàn)室建立的方法進(jìn)行檢測時，經(jīng)典RHDV的擴(kuò)增產(chǎn)物大小為591 bp;用鑒別經(jīng)典RHDV與RHDV2 RT-PCR方法時，經(jīng)典RHDV的擴(kuò)增產(chǎn)物大小為193 bp，RHDV2擴(kuò)增產(chǎn)物大小為829 bp;用OIE推薦的方法檢測時，RHDV2擴(kuò)增產(chǎn)物大小為481 bp。

1.5病毒基因序列的同源性分析

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至南京擎科生物科技有限公司測序。用DNAStar中的MegAlign軟件對新分離毒株vp60基因序列的測序結(jié)果進(jìn)行同源性分析，并將基因序列上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫。

1.6病毒的遺傳進(jìn)化分析

vp60基因是RHDV結(jié)構(gòu)蛋白基因，OIE以vp60基因作為RHDV分型的依據(jù)。從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得國內(nèi)外經(jīng)典RHDV毒株（登錄號：AF231353、AF402614、DQ205345、FJ794180、JN165235、KU207100）、RHDV2毒株（登錄號：FR819781、HE819400、JX133161、KP129397、KM115712）和兔杯狀病毒（Rabbit calicivirus， RCV）（登錄號：X96868）的vp60基因序列，對這些序列構(gòu)建進(jìn)化樹并進(jìn)行分析。

1.7病毒的復(fù)制分析

在嚴(yán)格的生物安全防控條件下，將疑似感染RHDV2的病死家兔肝臟組織樣品與磷酸緩沖鹽溶液按1 g∶10 ml混合后研磨成懸液，分別頸部皮下注射5只非免疫的25日齡未斷奶仔兔和5只2月齡兔，注射量均為每只1 ml，隨后觀察家兔的發(fā)病、死亡情況。取死亡家兔的肝臟組織進(jìn)行血凝試驗(yàn)和用于鑒定經(jīng)典RHDV與RHDV2的RT-PCR試驗(yàn)，將擴(kuò)增產(chǎn)物送至南京擎科生物科技有限公司測序。

2結(jié)果與分析

2.1紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)

紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)結(jié)果表明，3只病死家兔的肝臟樣本中，樣品2的肝臟出現(xiàn)血凝現(xiàn)象，樣品1、樣品3均未出現(xiàn)肉眼可見的血凝現(xiàn)象。

2.2病毒的PCR鑒定

以病毒cDNA為模板，用經(jīng)典RHDV鑒定引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，圖1A顯示，3個樣品在591 bp位置均未出現(xiàn)特異性條帶;使用OIE推薦的RHDV2鑒定引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，圖1B顯示，3個樣品在481 bp位置均出現(xiàn)特異性條帶，其中樣品2的擴(kuò)增條帶亮度較強(qiáng);用經(jīng)典RHDV與RHDV2鑒別引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，圖1C顯示，3個樣品在829 bp位置均出現(xiàn)RHDV2的特異性條帶，在193 bp位置未出現(xiàn)經(jīng)典的RHDV特異性條帶。

2.3vp60基因的序列分析

測定RHDV2擴(kuò)增產(chǎn)物（大小為829 bp）的vp60基因序列并將其上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫中（登錄號：MT383748），將其命名為SC2020。表1的分析結(jié)果顯示，本研究所擴(kuò)增序列與GenBank上報道的經(jīng)典RHDV（基因型為GI.1）的vp60基因（登錄號：AF231353、AF402614、DQ205345、FJ794180、JN165235、KU207100）的核苷酸序列一致性為77.5%～80.1%，與RHDV2（基因型為GI.2）vp60基因（登錄號：FR819781、HE819400、JX133161、KP129397、KM115712）的核苷酸序列一致性為93.6%～96.1%。

2.4vp60基因的遺傳進(jìn)化分析

用MEGA 5.2對病毒的vp60基因核苷酸序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，由圖2可以看出，新分離的病毒毒株與RHDV2（基因型為GI.2）的親緣關(guān)系較近，并位于同一個大的分支，與RHDV（基因型為GI.1）的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.5病毒的復(fù)制情況

分別用樣品2的肝臟懸液注射5只25日齡非免疫的未斷奶仔兔和5只2月齡兔，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10只家兔均在注射后24～48 h死亡。取死亡家兔的肝臟組織進(jìn)行紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)，結(jié)果顯示，2月齡兔中，有1只出現(xiàn)明顯的血凝現(xiàn)象，有2只出現(xiàn)較弱的血凝現(xiàn)象，有2只未出現(xiàn)血凝現(xiàn)象;未斷奶仔兔中，有2只出現(xiàn)明顯的血凝現(xiàn)象，有3只出現(xiàn)較弱的血凝現(xiàn)象。對死亡家兔的肝臟組織進(jìn)行經(jīng)典RHDV與RHDV2鑒別RT-PCR試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)均出現(xiàn)了單一的RHDV2特異性條帶。進(jìn)一步對該條帶進(jìn)行測序，結(jié)果表明，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測序結(jié)果與攻毒毒株的序列一致。

3討論

RHDV2自2010年首次在法國被報道以來，已逐步取代經(jīng)典RHDV而在歐洲蔓延，并開始在世界范圍內(nèi)流行。中國在2017年以前的RHDV流行株主要是經(jīng)典RHDV中的G2和G6型，并且存在G2/G6的重組毒株[2-3]。通過對RHDV新分離毒株SC2020的序列分析，其毒株與RHDV2毒株的核苷酸序列一致性達(dá)93%以上，與經(jīng)典型RHDV毒株的核苷酸序列一致性約為80%。通過遺傳進(jìn)化分析可知，新分離毒株SC2020與RHDV2毒株位于同一個分支，表明本研究所分離的RHDV新毒株為RHDV2，這是在中國首次發(fā)現(xiàn)RHDV2毒株。

中國RHDV的臨床樣本檢測主要使用行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)推薦的人“O”型紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)方法，該方法易于操作，但存在假陰性和假陽性的可能。國內(nèi)外均報道過低血凝和無血凝RHDV毒株的存在。由于在基層臨床檢測中較少使用RT-PCR方法和酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme linked immune sorbent assay，ELISA）測定，因此，檢驗(yàn)人員通過血凝試驗(yàn)進(jìn)行檢測時可能由于血凝試驗(yàn)呈陰性而判定為非RHD，導(dǎo)致漏診、誤診。在本研究中，最初3只病死家兔中有2只的肝臟組織沒有出現(xiàn)血凝現(xiàn)象，在后續(xù)病毒復(fù)制試驗(yàn)中，有2只死亡家兔的肝臟組織也沒有出現(xiàn)肉眼可見的血凝現(xiàn)象，而病死家兔均出現(xiàn)RHD的典型癥狀，且其肝臟樣品經(jīng)RT-PCR方法檢測和測序，其毒株均鑒定為RHDV2。中國已有的檢測經(jīng)典RHDV的實(shí)驗(yàn)室診斷方法可能并不適用于RHDV2的特異性檢測，例如檢測RHDV的RT-PCR方法[8]和檢測RHDV的膠體金免疫層析試紙條法等[10]。國外已經(jīng)建立了檢測RHDV2的實(shí)時熒光定量PCR方法[11-12]和夾心ELISA方法[13]，但是否能用于中國新發(fā)現(xiàn)毒株的檢測還有待進(jìn)一步確認(rèn)。筆者所在實(shí)驗(yàn)室建立的鑒別經(jīng)典RHDV與RHDV2的RT-PCR方法，可以有效鑒別經(jīng)典RHDV和RHDV2，這為應(yīng)對中國出現(xiàn)的RHDV2感染或經(jīng)典RHDV/RHDV2混合感染病例的鑒定提供了有效方法，可用于中國RHDV毒株的檢測及鑒別診斷。

本研究的3只死亡家兔此前已免疫接種由經(jīng)典RHDV毒株制備的組織滅活疫苗，但是不能有效抵抗RHDV2的感染，這與國外相關(guān)報道[5]相符。因此可以推測，RHDV2一旦在中國流行，將對養(yǎng)兔業(yè)產(chǎn)生嚴(yán)重的危害甚至造成毀滅性的打擊。鑒于中國可能出現(xiàn)由RHDV2引起的RHD暴發(fā)和流行，RHDV2的疫苗研制已刻不容緩。在加強(qiáng)RHD流行病學(xué)調(diào)查的基礎(chǔ)上，應(yīng)加快RHDV2組織滅活疫苗或基因工程疫苗的研制，從而保障中國養(yǎng)兔業(yè)的健康發(fā)展。

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（責(zé)任編輯：徐艷）