基于表型的重樓屬種質遺傳多樣性分析

尹曉蛟，何銀生，王智，吳德智，周武先，楊旭*

(1.湖北生態工程職業技術學院，湖北 武漢 430200； 2.湖北省農業科學院 中藥材研究所，湖北 恩施 445000;3.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208)

重樓屬是百合科植物中藥用價值和經濟價值最為重要的一個屬，在我國具有悠久的藥用歷史，其主要藥用部位是根狀莖，有清熱解毒、消腫止痛等功效，為云南白藥、宮血寧、奪命丹等經典中成藥的主要原料。重樓作為珍貴藥材表現出的可觀的經濟價值驅使人們掠奪式采挖，導致野生重樓種群數量越來越少，唯有通過人工栽植才能保證資源可持續利用。重樓種植產業發展的同時也對良種選育提出了更高的要求。一直以來，國內外研究者更偏重重樓的藥理活性、化學成分分析、快繁和人工栽培技術分析，重樓種質資源遺傳多樣性的研究成果則相對較少。近年來，重樓遺傳多樣性分析主要采用分子標記手段進行基因水平研究[1-5]，作為遺傳多樣性表現形式之一的表型性狀多樣性分析在重樓中卻鮮見報道。

鑒于此，本研究以13種重樓屬植物為材料，通過對其18個表型性狀指標的數量分析，了解供試重樓種質的表型變異程度，基于表型性狀數據對各種質進行聚類分析以揭示它們的親緣關系，并采用主成分分析方法和相關性分析方法分析與重樓產量關系密切的主要表型特征，以期為重樓種質的遺傳改良和新品種選育提供研究依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的重樓種質材料共13份，編號如下：1，毛重樓；2，多葉重樓；3，球藥隔重樓；4，短瓣球藥隔重樓；5，黑籽重樓；6，矮重樓；7，金線重樓；8，亮葉重樓；9，啟良重樓；10，狹葉重樓；11，華重樓；12，長藥隔重樓；13，凌云重樓。2019年5月采自湖北省農業科學院中藥材研究所的重樓種質資源圃。

1.2 性狀測定

選擇具有代表性、遺傳相對穩定、易于獲得和測定的18個表型性狀，包括株高、根莖長、根莖粗、根莖干質量、基莖粗、葉片數、花梗長、花瓣長、雄蕊長、雄蕊數、花柱裂、葉片長、葉片寬、葉柄長、萼片數、萼片長、萼片寬、總葉面積。用卷尺測量株高、根莖長、花梗長、花瓣長、雄蕊長、葉片長、葉片寬、葉柄長、萼片長、萼片寬，精確到0.1 cm。用游標卡尺測量根莖直徑、基莖直徑，精確到0.01 cm。其中，根莖直徑為根狀莖最粗處的直徑，基莖直徑為直立莖基部的直徑。根莖干質量用電子天平稱量，精確到0.01 g?？側~面積用葉片形態測量儀測量。

利用Shannon-weaver多樣性指數(H′)評價表型遺傳多樣性，計算公式：

H′=-∑PilnPi。

式中，Pi為某性狀第i級別材料份數占材料總數的百分比，其中數值性狀的分級按照第1級[Xi<(X-2δ)]到第10級[Xi>(X+2δ)]，每0.5δ為1級。

供試重樓表型性狀遺傳多樣性的聚類分析借助NTsys-pc 2.1軟件完成，在聚類分析前對原始數據進行標準化處理，通過軟件計算各材料間的卡方距離，并按非加權配對算數平均法(unweighted pair group method using arithmetic average, UPGMA)對不同重樓種質資源材料進行聚類，生成樹狀聚類譜系圖。

1.3 數據處理

利用Excel 2003軟件統計數值性狀的平均值、最大值、最小值、標準差、變異系數。用SPSS 22.0軟件對表型性狀做相關性分析和主成分分析。

2 結果與分析

2.1 多樣性

重樓各數量性狀的變異情況見表1，各表型性狀的變異系數差異較大。葉柄長度的變異系數最高，達到87.10%，說明種質間葉柄長度差異大，離散程度高。變異系數最低的是根莖直徑，為12.01%，表明各種質的根莖直徑穩定性較好。

表1 重樓屬種質表型性狀遺傳變異分析

注：**表示差異達到1%顯著水平，*表示差異達到5%顯著水平。

供試種質性狀的Shannon-Weaver多樣性指數為1.88～2.66，變幅較大，平均2.30；除花瓣長、根莖直徑和根莖干質量3個性狀外，其余15個測量性狀多樣性指數都在2.0以上。表明13份重樓屬種質資源材料表型性狀的遺傳多樣性指數較高，供試各種質在葉、花、根莖與株高的多個性狀均表現出豐富的多樣性，這種豐富的變異不僅為優異種質選擇提供源泉，而且為保護生物多樣性提供了物質基礎。

F值檢驗可以看出，株高、根莖長、基莖直徑、葉片數、葉片長、葉片寬等15個性狀在群體間的差異達到極顯著(P<0.01)水平，萼片寬在群體間存在顯著(P<0.05)差異，根莖直徑和根莖干質量在各種質之間差異不顯著。表明野生種源在試驗地經過多代馴化栽培后，仍保留各自典型的性狀特征，各種質材料間的大部分性狀差異明顯，僅根莖的質量和粗壯程度與種質來源無顯著關系。

2.2 主成分

本研究對供試樣本的18個表型性狀進行了主成分分析，從而計算出這些表型性狀的特征值、方差貢獻率、累計貢獻率和因子載荷值等參數。在累計貢獻百分比高于85%時，共發現5個主成分(表2)。主成分1～5的特征值分別是5.947、5.217、2.383、1.414、1.044；主成分貢獻率分別是33.037%、28.984%、13.242%、7.855%、5.800%，前5個主成分的累計貢獻率達到88.918%(表3)。第一主成分的總葉面積、花梗長、萼片長、葉片長、根莖直徑、基莖直徑、株高的特征向量值最大，且均為正值，可以理解為第一主成分是跟體型大小相關的綜合指標；第二主成分的雄蕊數、萼片數、花柱裂的特征向量值最大，均為正值，是與花的特性相關的綜合指標；第三主成分的根莖長、根莖重的特征向量值最大，且均為負值，是與根莖有關的因子；第四主成分的花瓣長的特征向量值最大；第五主成分的葉片數特征向量值最大。貢獻率較大的性狀是造成重樓表型差異的主要因素。以上主成分分析結果表明，株型大小的多樣性最高，其次是花部元件的數量。這些性狀因子可視為今后重樓種質評價與雜交育種中親本選擇的主要表型指標。

2.3 聚類

13種重樓屬植物的聚類分析結果如圖1所示，在卡方距離0.10處，將重樓樣本分為5個類群。

第Ⅰ類群包括毛重樓、球藥隔重樓、短瓣球藥隔重樓、啟良重樓、華重樓和長藥隔重樓，該類群個體高大，花梗長于其他個體；其中華重樓和長藥隔重樓性狀指標最接近。

表2 重樓屬種質材料18個表型性狀的主成分分析

表3 前5個主成分分析結果

第Ⅱ類群包括亮葉重樓、黑籽重樓和金線重樓；此類群株型中等、根莖干質量高于其他種質。黑籽重樓與金線重樓在株高、葉片數量、長度寬度等性狀上表現極相似。

第Ⅲ類群僅包含凌云重樓。凌云重樓直立莖、葉片、根莖、萼片等營養器官的大小顯然不占優勢，但其花柱裂、雄蕊數、萼片數在所有種質材料中表現出較高值。

第Ⅳ類群包括矮重樓和狹葉重樓，二者葉片數較多，葉面積小，幾乎無葉柄。

第Ⅴ類群以多葉重樓獨立為一類。表現為株型矮小，葉面積大，葉片數多。

2.4 主要數量性狀相關性

供試重樓種質18個數量性狀的相關性分析結果見表4。結果表明，各性狀間普遍存在或顯著或極顯著相關性，表現為正相關或負相關。與基莖直徑顯著相關的性狀最多，達到12個，株高、根莖干質量、葉片數、葉片長、萼片數、萼片長、花梗長、花瓣長、雄蕊數、雄蕊長、花柱裂、總葉面積與基莖直徑都呈極顯著正相關；與葉片數、花梗長、總葉面積相關的性狀均為9個；與根莖長度相關的性狀最少，只有株高與根莖長度呈極顯著的正相關。本實驗中，反映重樓產量的指標根莖干質量僅與雄蕊數呈極顯著負相關，與萼片數呈顯著負相關，與地上部分的其他性狀沒有顯著相關關系。

圖1 基于18個性狀的重樓屬種質資源聚類

表4 重樓屬種質資源表型性狀相關分析

注：*表示在P<0.05水平上顯著相關，**表示在P<0.01 水平上顯著相關。1，株高；2，根莖長；3，根莖直徑；4，根莖干質量；5，基莖直徑；6，葉片數；7，葉片長；8，葉片寬；9，葉柄長；10，萼片數；11，萼片長；12，萼片寬；13，花梗長；14，花瓣長；15，雄蕊數；16，雄蕊長；17，花柱裂；18，總葉面積。

3 討論

本研究對恩施當地13種重樓屬種質進行表型性狀多樣性分析、主成分分析、聚類分析和性狀間的相關性分析。性狀多樣性分析結果顯示，參試種質的葉、花、根莖與株高等多個性狀均表現豐富的多樣性，其中對重樓產量起決定性作用的根莖長度、根莖最大直徑和根莖干質量多樣性指數較高，說明在育種工作中可利用現有種質資源提高重樓的產量潛力。

從聚類分析結果來看，毛重樓、球藥隔重樓、短瓣球藥隔重樓、啟良重樓、華重樓和長藥隔重樓聚為一類，與它們在重樓植物分類地位中均屬于南重樓組這一結論一致[6]。前人的研究還表明，啟良重樓、華重樓和長藥隔重樓均為多葉重樓的變種，短瓣球藥隔重樓是球藥隔重樓的變種[6]，因為親緣關系近而具有相似的表型。多葉重樓在長期的栽培過程中受到環境的影響，表型漸漸發生變化，與其變種的共性減少，可能是造成其單成一類的原因。聚類結果還顯示，黑籽重樓和金線重樓更容易較早地聚在一起，然而以上被試材料的ISSR分析結果顯示兩者遺傳相似度低，不能聚為一類，這與李壯等[2]對重樓的遺傳多樣性研究中發現黑籽重樓和金線重樓親緣關系較遠的觀點有差異。

從主成分分析結果來看，葉片長、葉片寬、植株高、根莖干質量、萼片寬等5個性狀是引起種間表型差異的最主要因素，但這類性狀參數僅僅在量上表現差異，且觀測值容易受環境影響，因此，本研究中將第2主成分貢獻較大的花萼數、雄蕊數和花柱裂3個表型性狀作為重樓種質間差異的主要來源。這與翁周等[7]對多葉重樓的研究結果相一致。

表型性狀相關性分析顯示，植株的各繁殖器官性狀之間、各營養器官性狀之間普遍具有極顯著相關性。而植株地下部分性狀與地上部分的某些性狀間存在一定相關性，這一結果與地黃種質主要數量性狀的相關性分析結果相似[8-9]。也提示重樓地上部分的某些性狀可作為高產重樓種質選育指標。這一推論在重樓的相關研究中尚未見報道，但在甘草[10]、白芷[11]、黃芩[12]等中草藥植物表型性狀相關性分析中已得到證實。