熒光競爭結合技術在昆蟲嗅覺相關蛋白結合能力檢測上的應用

彭 竹，黃 麗，趙慧婷

(山西農業大學生命科學學院， 太谷 030801)

在自然生態系統中，昆蟲時刻處于各種氣味環境中，它們通過嗅覺系統對環境中的各類氣味分子進行選擇性識別，進而激發機體產生相應的生理或行為反應[1]。昆蟲對氣味物質的識別是一個復雜的過程,如圖1所示，觸角是其主要的嗅覺識別器官。氣味分子與觸角接觸后，通過觸角表皮的微孔進入水溶性感器淋巴液中，首先與淋巴液中的可溶性蛋白-氣味結合蛋白(odorant-binding proteins，OBPs)或化學感受蛋白(chemosensory proteins，CSPs)結合，之后被轉運到感覺神經元樹突膜上，并激活膜表面上的氣味受體(odorant receptors，ORs)或離子受體(ionotropic receptors，IRs)發生信號轉導，將化學信號轉化為電信號并傳遞至觸角葉，進而激活腦部中樞神經系統，指導昆蟲做出相應的行為或生理反應[3]。由此可見，對昆蟲嗅覺相關蛋白的鑒定和嗅覺識別過程的探索能夠為發展新型病蟲害防治技術、科學管理經濟昆蟲提供新的角度[4]。

圖1 昆蟲外周嗅覺神經系統信號轉導示意圖[2]Fig.1 Schematic diagram of signal transduction of insect peripheral olfactory nervous system[2]SNMP：感覺神經元膜蛋白；ODE：氣味降解酶；LUSH：果蠅氣味結合蛋白67a；圖中“？”表示該部分通路尚未明確；OrX：氣味受體X，指某一個氣味受體基因；Orco：氣味共受體SNMP:Sensory neuron membrane protein;ODE:Odor degrading enzymes;LUSH:Odorant binding protein67a of Drosophila;“?” represents the path of this part is not clear；OrX：Odorant receptor X,represents a certain gene in the odorant receptor;Orco:Odorant receptor co-receptor

熒光競爭結合試驗(fluorescence competitive binding assay)是當前普遍采用的測定昆蟲OBPs和CSPs配體結合特性的典型方法，由于其操作簡便安全、價格低廉、安全系數高且試驗結果穩定，從而受到了越來越多的關注[5,6]。試驗中利用熒光分光光度計進行熒光光譜掃描并記錄熒光強度變化，熒光強度下降的幅度與氣味分子和OBPs/CSPs內部的疏水性氨基酸殘基的結合能力直接相關，氣味分子與熒光探針的競爭結合能力越強，熒光值下降越大，即可通過該方法得到昆蟲OBPs/CSPs與環境中氣味物質或其他揮發性化學信息素的結合能力[7]。在昆蟲中首次進行熒光競爭結合試驗使用的熒光探針為1-氨基蒽(1-Anthracenamine，AMA)，利用該方法分別檢測了多音天蠶蛾(Antheraeapolyphemus)和甘藍夜蛾(Mamestrabrassicae)的 OBPs對一系列配體的非特異性結合能力[8]。也有研究者在家蠶信息素結合蛋白1(pheromone binding protein 1)pH依賴性結構柔韌性的研究中用到了熒光探針8-苯胺-1-萘磺酸(8-Anilino-1-naphthalenesulfonic acid，1,8-ANS)[9]。目前，運用最廣泛的熒光探針是N-苯基-1-萘胺(N-phenyl-1-naphthylamine，1-NPN)。

1 熒光競爭結合試驗的原理

熒光競爭結合試驗的原理是利用熒光探針具有發射熒光的特性，與OBPs/CSPs混合后熒光值會顯著增強。加入氣味分子后，氣味分子將和熒光探針競爭結合OBPs/CSPs。氣味分子與OBPs/CSPs的結合能力越強，則OBPs/CSPs-熒光探針復合物的熒光強度值下降越大。通過線性化方程來計算熒光探針和OBPs/CSPs的解離常數Ki[10,11]，就可以分析OBPs/CSPs與其他化學配基的相互結合關系，從而推測特定蛋白的生理功能。熒光競爭結合試驗也存在一些缺陷，該方法屬于間接測定OBPs/CSPs與氣味分子的結合能力，要求目的蛋白必須與熒光探針結合且狀態穩定，并且二者結合后不會影響目的蛋白的理化性質、空間構象及動力學等特性[12]，但該方法仍是目前用于研究昆蟲OBPs/CSPs功能的常用手段，已被廣泛應用。

2 熒光競爭結合試驗在嗅覺相關蛋白上的應用

2.1 熒光競爭結合試驗在OBPs上的應用

2.1.1 昆蟲OBPs的特征

OBPs是一類水溶性的球形蛋白，一般包括120～150個氨基酸，分子量大小為10～30 kD。昆蟲的OBPs首次在雄性多音天蠶蛾的觸角中被鑒定[13]，通常將OBPs分為信息素結合蛋白(pheromone-binding proteins，PBPs)和一般氣味結合蛋白(general odorant binding proteins，GOBPs)[14-16]。OBPs與氣味分子結合開啟了昆蟲通過嗅覺系統感知外界環境關鍵的一步，二者結合后OBPs將氣味分子輔助運輸到神經元樹突膜上，隨后發生電信號的產生、傳遞與整合，最終指導昆蟲做出相應的應答反應[17]。

2.1.2 熒光競爭結合試驗在蜜蜂OBPs中的應用

蜜蜂是一類社會性昆蟲，以其特有的生物學本能參與大自然的生態平衡。蜜蜂能促進農作物、果樹、瓜類、牧草等的授粉，顯著提高其產量和質量，在現代化農業生產中發揮著重要作用[18]。Zhao等[19]比較了中華蜜蜂(Apisceranacerana)AcerOBP5基因和意大利蜜蜂(Apismelliferaligustica)AmelOBP5基因的序列、時序表達模式，并利用熒光競爭結合試驗分別檢測了兩個基因的重組蛋白與感染白堊病的蜜蜂幼蟲揮發性化合物成分苯甲醇、2-苯乙醇和乙酸苯乙酯三種配體的結合特性。結果表明，AcerOBP5對乙酸苯乙酯具有較高的結合親和力，而AmelOBP5對該配體沒有明顯的親和力；AmelOBP5對苯甲醇和2-苯乙醇都有很高的結合親和力，但AcerOBP5對這兩個化合物的結合親和力適中，故OBP5在這兩種生物體內可能發揮著不同的功能。有研究報道，苯乙酸乙酯能引起蜜蜂感染時的衛生行為[10], 因此其推測中華蜜蜂AcerOBP5蛋白可能介導蜜蜂的衛生行為，從而能夠更好地預防疾病的發生。

Song等[20]利用熒光競爭結合試驗研究了東方蜜蜂(Apiscerana)AcerOBP11蛋白與蜜蜂多種信息素成分的結合特性，結果表明，AcerOBP11不僅與下頜骨信息素、對羥基苯甲酸甲酯、E-9-氧-2-癸酸等多種信息素成分有較強的結合親和力，也與植物揮發物如4-烯丙基藜蘆醚等有較強的結合親和力。故其推測AcerOBP11具有復雜的配體結合特性，具有雙重功能，主要功能是感知各種蜜蜂信息素，次要功能是感知一般氣味。

2.1.3 熒光競爭結合試驗在農業害蟲OBPs中的應用

甘薯蟻象(Cylasformicarius)又稱甘薯小象甲，是甘薯上的重要害蟲，其成蟲啃食甘薯的莖蔓與葉柄的皮層，影響甘薯的生長發育，幼蟲在薯塊內取食，造成甘薯產量損失嚴重，甚至絕產[21,22]。賈小儉等[23]從甘薯蟻象成蟲觸角中克隆了CforOBP8基因，利用熒光競爭結合試驗測定了純化的重組蛋白OBP8與1種性信息素、15種植物揮發物的結合能力，結果顯示CforOBP8蛋白與性信息素(E)-2-丁烯酸順-(Z)-3十二烯基酯結合親和力最強，其次與乙酸順-3-己烯酯、檸檬烯、橙花醇、壬醛和苯乙醛5種植物揮發物也有一定的結合能力，故CforOBP8可能是甘薯蟻象的性信息素結合蛋白，并且在感受性信息素和寄主植物揮發物的過程中發揮作用。

蛀果蛾(Carposinasasakii)，俗名桃小食心蟲，是一種主要危害桃子、蘋果、梨等的果樹害蟲，其幼蟲在孵化后會迅速滲透到果實中，并以果實內部的果肉為食，因此很難使用化學藥劑減少幼蟲數量。鑒于蛀果蛾的這一特點，對其進行廣泛地研究進而達到有效地控制就顯得尤為重要[24]。Tian等[25]利用熒光競爭結合試驗測定了蛀果蛾CsasPBP1-3和CsasGOBP1-2蛋白與18種蘋果植物揮發物、2種性信息素成分的結合親和力。結果表明，CsasPBP1-3和CsasGOBP1-2均與7順-二十碳烯-11-酮表現出較強的結合親和力，蛀果蛾CsasPBP3對7順-二十碳烯-11-酮和7順-十九碳烯-11-酮2種性信息素成分均表現出特異性的親和作用，CsasPBP1與性信息素組分和其他植物揮發物都具有較高的結合親和力，CsasGOBP1和CsasGOBP2與植物揮發物中的普通組分的結合親和力較高，故推測蛀果蛾CsasPBPs和CsasGOBPs在性信息素和寄主植物揮發物的感知中起著獨特的生理作用。

目前，利用熒光競爭結合試驗已測定了如鱗翅目、半翅目、同翅目、雙翅目、鞘翅目等多類農業害蟲OBPs的結合功能[6,26-29]。表1中歸納了5種昆蟲的OBPs的氨基酸數目、分子量、結合力較強的氣味物質以及其潛在功能[30-34]，這些研究有助于深入了解來自環境中或生物體本身的氣味分子作用于昆蟲嗅覺器官引起昆蟲產生行為反應的機制，并為害蟲引誘劑或驅避劑的研發提供了潛在的分子靶標。

表1 五種昆蟲OBPs氨基酸個數、分子量、結合物質及功能Tab.1 Amino acid number, molecular weight, binding substances and functions of OBPs in five insect species

2.2 熒光競爭結合試驗在CSPs上的應用

2.2.1 昆蟲CSPs的特征

CSPs是從昆蟲中鑒定出來的另一類低分子量、酸性、可溶性嗅覺蛋白家族，分子量大小為10～20 kD，具有4個保守的半胱氨酸，形成2個二硫鍵，包含6個α螺旋的緊密多肽，形成疏水結合腔。CSP的多樣性主要是由氨基酸序列的C末端所決定，有些CSP的C端含有100～200個延伸的氨基酸，可使蛋白的總長度達到200～300個氨基酸。不同種類昆蟲的CSPs系統發育分析表明，CSPs具有高度保守性[35,36]。CSPs在昆蟲的觸角、頭、足、腹部、腺體、下顎須和下唇須等各個器官和組織都有表達，主要參與配體與受體的結合，大量存在于化學感器的淋巴液中，是化學感受過程中信息素和氣味分子的載體[37,38]，CSPs可能還參與識別、捕獲和將疏水性化學物質從環境轉移到嗅覺受體等化學過程[39]。到目前為止，只在昆蟲這一生物類群中發現了CSPs[40]。

2.2.2 熒光競爭結合試驗在蜜蜂CSPs中的應用

中華蜜蜂是我國特有的當家蜂種，具有善于利用零星分散的蜜粉源、嗅覺靈敏、抗病抗逆能力強等優點，適合在我國山林地區定地飼養[16,41]。李紅亮課題組[15]利用熒光競爭結合試驗研究了中華蜜蜂CSP3的配基結合功能，在候選配基競爭1-NPN與中華蜜蜂AcerCSP3結合的試驗中，β-紫羅蘭酮、3，4-二甲基苯甲醛、苯乙醛、4-烯丙基藜蘆醚及水楊酸甲酯5種花香氣味物質的配基使1-NPN的相對熒光強度明顯下降，表明5種花香物質與AcerCSP3均有較強的結合能力，其中3，4-二甲基苯甲醛與AcerCSP3的結合能力最強。研究結果表明，AcerCSP3可能作為中華蜜蜂嗅覺化學感受系統的一部分，在蜜蜂搜尋某些植物的蜜粉源時作為氣味分子的運載體發揮一定的作用。隨后，Li等[42]又采用熒光競爭結合試驗、熱力學方法和分子對接技術，研究了吡蟲啉這一新煙堿類殺蟲劑與中華蜜蜂AcerCSP1的相互作用，揭示了吡蟲啉對蜜蜂化學感受系統生理功能的影響。

2.2.3 熒光競爭結合試驗在農業害蟲CSPs中的應用

東方粘蟲(Mythimnaseparata)是一種廣泛分布于水稻、小麥、玉米等多種谷類作物的鱗翅目(Lepidoptera)夜蛾科(Noctuidae)害蟲。它廣泛分布在亞洲、大洋洲和非洲，影響著作物的產量和質量，每年都會造成嚴重的經濟損失[43]。Younas等[44]為了探討CSPs在東方粘蟲中的功能，研究了MsepCSP8在東方粘蟲中的表達模式，分析了不同pH下MsepCSP8與配體的結合親和力。熒光競爭結合試驗結果表明，pH顯著影響配體與MsepCSP8的結合親和力，在pH 7.4時，它與56種植物揮發物中的20個配體的結合力比在pH 5.0時的結合力更強。結合其結構建模、分子對接和行為反應等試驗推測,MsepCSP8可能參與介導東方粘蟲成蟲對植物揮發物的反應并具有接收化學信號的功能。

西花薊馬(Frankliniellaoccidentalis)又稱苜蓿薊馬，是一種以植物為食的昆蟲，每年會對許多蔬菜、果樹和農作物造成嚴重損害，包括蘋果、葡萄、西紅柿、茄子和菊花。此外，西花薊馬是一些病毒的載體，包括番茄斑點枯萎病病毒。為了有效地控制這種害蟲，Zhang等[45]從分子生物學角度入手，以1-NPN為熒光探針進行熒光競爭結合試驗，測定了寄主植物釋放的19種揮發性物質與FoccCSP的結合親和力。結果顯示，茴香醛、香茅醇、水楊酸甲酯與FoccCSP結合親和力高，而這些物質主要是從小茴香、八角、蔥、白花茄和黃瓜中提取的，說明FoccCSP對西花薊馬識別、尋找、定位和取食這些寄主植物具有重要作用。

另外，熒光競爭結合試驗在棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera)HarmCSP6[46]、金龜子甲蟲(Holotrichiaoblita)HoblCSP2[47]、大草蛉(Chrysopapallens)CpalCSP3[48]、白背飛虱(Sogatellafurcifera)SfurCSP5[26]、二化螟(Chilosuppressalis)CSPs[49]、松褐天牛(Monochamusalternatus)MaltCSPs[50]等多種農業害蟲上得到了廣泛應用。表2總結了6種昆蟲的CSPs的氨基酸數目、分子量、結合力較強的氣味物質及其潛在功能，為探索有害昆蟲的嗅覺機制、揭示昆蟲與環境化學信息聯系的規律提供了科學依據。

表2 六種昆蟲CSPs氨基酸個數、分子量、結合物質及功能Tab.2 Amino acid number, molecular weight, binding substances and functions of CSPs in six insect species

3 總結與展望

近年來，農業生產中大量使用殺蟲劑，如噴施化學農藥一直是應對和防治草地貪夜蛾(Spodopterafrugiperda)、水稻害蟲、小菜蛾(Plutellaxylostella)等的主要手段[51-53]。但是在使用農藥防治害蟲的同時，其對非靶標生物、環境、土壤等也產生了明顯不良的影響，如新煙堿類農藥吡蟲啉，在靶向農業害蟲的同時，也削弱了授粉昆蟲(如蜜蜂)的免疫系統，影響了其采集與授粉行為[54]。因此，找到一種有效的害蟲生物防治方法十分重要。

昆蟲的許多行為都與嗅覺系統中各類蛋白的作用緊密相關，這些蛋白可以作為干擾昆蟲嗅覺系統的分子靶點。本文通過對昆蟲OBPs和CSPs配體結合能力的研究進行梳理，可以看出，大多數昆蟲OBPs和CSPs的功能是感知氣味物質，并主要參與寄主植物的識別、選擇，也有部分OBPs和CSPs可以感知信息素組分，可能在昆蟲的繁殖行為中發揮作用。鑒于熒光競爭結合試驗在蛋白功能的鑒定上存在一定的缺陷和風險，因此需要結合時空表達譜分析、分子對接、電生理、RNA干擾、行為學等試驗技術共同探究目的基因或蛋白的具體功能。

目前昆蟲OBPs、CSPs蛋白的理化特征、表達模式已逐步明了，通過熒光競爭結合試驗等技術對其功能也有了較為深刻的理解，但仍存在諸多尚未探明的問題，如昆蟲嗅覺系統中各種蛋白相互作用的機制以及OBPs和CSPs在觸角以外器官中的生理功能等。對這些問題開展研究將有助于了解昆蟲感知外界環境這一生命過程，從真正意義上了解昆蟲的嗅覺機理，從而達到防控或利用昆蟲的目的。