慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉基因表達譜的生物信息學分析

陳 鋼，于 洋，王林娥

(1.首都醫科大學附屬北京友誼醫院耳鼻咽喉頭頸外科， 北京100050；2.寧夏醫科大學總醫院耳鼻咽喉頭頸外科， 銀川 750004)

慢性鼻-鼻竇炎合并鼻息肉(chronic rhinosinusitis with nasal polyps，CRSwNP)是慢性鼻-鼻竇炎(chronic rhinosinusitis，CRS)的分類之一，其特征是鼻腔粘膜持續的息肉樣炎癥[1]。盡管CRSwNP僅占所有CRS病例的25%～30%，但CRSwNP被認為是一種嚴重影響患者的生活質量和生產力，并伴有巨大的經濟負擔的疾病[2]。鼻內窺鏡技術的普及應用使越來越多的鼻息肉患者得到了治療，但是仍然有一些患者治療效果不佳，甚至出現復發，因此還需要通過對其發病機制深入研究才能獲得答案。隨著基因芯片技術的發展，對基因表達譜芯片數據進行深入挖掘，可以為探尋各種疾病分子機制提供一種全新研究技術手段。因此本研究通過對美國國立生物信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的基因表達數據庫(Gene Expression Omnibus，GEO)[3,4]中慢性鼻竇炎伴鼻息肉基因芯片表達譜數據的挖掘，來研究鼻息肉的關鍵通路、差異表達基因(differentially expressed genes，DEGs)及這些基因產物之間的相互作用，希望能夠拓展鼻息肉機制的研究思路，并為鼻息肉發生發展的分子機制研究提供參考。

1 材料與方法

1．1 數據來源

從NCBI基因表達數據庫下載慢性鼻竇炎伴鼻息肉基因芯片表達譜數據(GSE36830)，該芯片數據由芝加哥西北大學范伯格醫學院的過敏和免疫科學者Atsushi Kato上傳。采用 GPL570平臺(Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array)，芯片數據包含 24個樣本，其中包括6例慢性鼻竇炎不伴有鼻息肉(chronic rhinosinusitis without nasal polyps，CRSsNP)患者的鉤突組織、6例慢性鼻竇炎伴鼻息肉(CRSwNP)患者的鉤突組織、6例CRSsNP患者的鉤突組織、6例對照組患者的鉤突組織以及6例CRSwNP患者的鼻息肉組織。鼻竇和鼻息肉組織來源于CRS患者的常規功能性內窺鏡鼻竇手術。對照組是在內窺鏡下切除顱底腦瘤和鼻內窺鏡下獲得的正常的鼻竇組織。

1．2 分析方法

1．2．1 基因芯片的處理與差異表達基因的篩選

使用GEO2R篩選正常鉤突和鼻息肉組織之間的差異表達基因。GEO2R是一個交互式的web工具，它允許用戶比較一個系列中的兩個或多個數據集，以便識別不同的數據集試驗條件。篩選條件：標準為|log2FC|≥2 &Pvalue≤0.01，通過Graph pad Prism 8軟件運行做差異基因可視化的火山圖。

1．2．2 DEGs的注釋和富集分析

采用Gene Ontology Resource數據庫，在戴維(Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery，DAVID，David v6.8)數據庫[5,6]中對篩選的差異基因進行基因本體富集(gene ontology，GO)分析、京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Gene and Genomes，KEGG)[7]信號通路分析，P<0.01時具有統計學意義。

1．2．3 差異基因蛋白互作網絡的構建

交互基因的搜索工具String數據庫是用于評估蛋白質相互作用信息的在線工具。String(版本11)[8]涵蓋了來自5 090種生物體的2 400萬種蛋白質信息。為了評估DEGs之間的交互關系，本研究應用Cytoscape軟件構建蛋白質相互作用網絡(protein-protein interaction network，PPI network)，使用cytoHubba插件篩選出前10位的關鍵基因，同時使用分子復合檢測(molecular complex detection，MCODE)插件蛋白質相互作用對網絡的模塊進行分析，使用這個工具的參數設置如下：Degree Cutoff:2;Node Score Cutoff:0.2;k-core:2;Max.Depth:100。

2 結果和分析

2．1 差異基因的表達分析結果

通過鼻息肉組與正常鉤突對照組樣本對比，總共54 675個基因被納入研究。基于上述的標準，篩選出699個DEGs，其中475個基因為上調 DEGs，224個基因為下調DEGs(圖1)。

圖1 差異基因的火山圖 Fig.1 The volcanic plot of the differential genes 紅色三角代表上調的 DEGs；綠色三角代表下調的DEGs；灰色圓點代表差異不顯著的基因The red triangles represent the DEGs that have been upgraded；The green triangles represent the DEGs that have been downgraded；The grey dots represent the genes with no significant(NS) differences

2．2 GO分析和KEGG分析結果

上傳所有的DEGs至在線分析工具David數據庫，以識別GO分析和KEGG分析。GO分析結果顯示，在生物過程(biological process, BP)中，上調的DEGs顯著富集的生物過程包括：炎癥反應(inflammatory response)、免疫反應(immune response)、細胞趨化性(chemotaxis)、炎癥反應的正向調節(positive regulation of inflammatory response)、細胞的粘附(cell adhesion)等；下調的DEGs顯著富集的生物過程包括：唾液分泌(saliva secretion)、生物礦物組織發展(biomineral tissue development)、細胞氨基酸生物合成過程(cellular amino acid biosynthetic process)、視網膜內穩態(retina homeostasis)及離子跨膜轉運(ion transmembrane transport)等(表1)。在分子功能(molecular function，MF)方面，上調的DEGs顯著富集的分子功能包括：外源性脂質抗原結合(exogenous lipid antigen binding)、β-2-微球蛋白結合(beta-2-microglobulin binding)、脂肽結合(lipopeptide binding)、碳水化合物結合(carbohydrate binding)、趨化因子活性(chemokine activity)等；下調的DEGs顯著富集的分子功能包括：鈣離子結合(calcium ion binding)、化學排斥物活性(chemorepellent activity)、轉運活性(transporter activity)、藥物結合(drug binding)、同一蛋白結合(identical protein binding)(表1)。此外，在細胞成分(cell component，CC)方面，上調的DEGs顯著富集的細胞成分包括：細胞質膜(plasma membrane)、細胞質膜外側(external side of plasma membrane)、細胞質膜的成分(integral component of plasma membrane)、細胞外空間(extracellular space)和細胞外區(extracellular region)；下調的DEGs顯著富集的細胞成分包括：細胞外空間(extracellular space)、細胞外區(extracellular region)、細胞外泌體(extracellular exosome)、突觸后膜(postsynaptic membrane)、細胞質膜的成分(integral component of plasma membrane)等(表1)。

KEGG 分析結果顯示，上調的 DEGs 在造血細胞系(hematopoietic cell lineage)、細胞因子-細胞因子受體相互作用(cytokine-cytokine receptor interaction)、破骨細胞分化(osteoclast differentiation)、趨化因子信號通路(chemokine signaling pathway)、癌癥中的轉錄失調(transcriptional misregulation in cancer)、哮喘(asthma)、金黃色葡萄球菌感染(Staphylococcusaureusinfection)等信號通路中富集，而下調的 DEGs 在唾液腺分泌(salivary secretion)及膽汁分泌(bile secretion)信號通路中富集(表2)。

2．3 PPI 網絡分析結果

基于String數據庫中的信息，使用Cytoscape(版本3．7．2)進行PPI網絡的分析，然后使用插件cytoHubba對關鍵基因進行篩選，排名前10的關鍵節點(Hubs)包括ITGAM、IL10、CD86、TLR8、ITGAX、CCL2、CCR7、SRC、EGF及ITGB2，其中ITGAM節點的度(degree)最高為82(圖2)。此外，使用插件MCODE對總共174個節點和1 527個邊界進行了分析，PPI網絡中提取出5個模塊(圖3)，選擇排名第1的子網絡，總共有37個節點和316個邊界。

表1 鼻息肉差異表達基因的GO分析Tab.1 GO analysis of differentially expressed genes in nasal polyps

表2 鼻息肉差異表達基因的KEGG分析Tab.2 KEGG analysis of differentially expressed genes in nasal polyps

圖2 PPI網絡分析Fig.2 Analysis of the PPI network(a)從PPI網絡中識別的排名前10的關鍵節點(Hubs)；(b)關鍵節點按照度(Degree)大小排列。y軸表示的是關鍵節點基因，x軸表示節點的度(a)Top 10 key nodes (Hubs) identified from PPI networks;(b)Hubs genes are arranged in order of Degree. The Y-axis represents the key node gene, and the X-axis represents the Degree of the node

圖3 PPI網絡中提取出5個模塊Fig.3 Five modules were extracted from PPI network(a)模塊1；(b)模塊2；(c)模塊3；(d)模塊4；(e)模塊5(a)Module 1;(b)Module 2;(c)Module 3;(d)Module 4;(e)Module 5

3 討論

鼻息肉是耳鼻喉科最常見鼻腔黏膜的慢性炎癥性疾病,在成年人中的發病率為1%～2%，組織病理學研究顯示，鼻息肉為呼吸上皮覆蓋的高度水腫的疏松纖維組織，間質中有大量炎癥細胞浸潤，多以嗜酸性粒細胞浸潤為主，但是其發病機制不清[9],已發現有多個基因、多個信號通路與鼻息肉發生有關。隨著基因芯片技術的發展，對基因表達譜芯片數據進行深入挖掘，可以為探尋各種疾病分子機制提供一種全新的研究技術手段。Benito等[10]研究了LTC4S、CYSLTR1、PTGDR和NOS2A基因在鼻息肉中多形態分析，發現這些基因與鼻息肉臨床關系密切，在鼻息肉發展中起著重要作用。Fraczekm等[11]應用基因芯片技術發現NOS2A、SERPINA1、UCP2、OXTR和IL-8基因在鼻息肉中表達升高，而LTF、KRT6B、LYZ、SD11B2和MMP-3表達降低。本研究利用生物信息學的方法，從GEO數據集中表達譜數據檢索到CRSwNP患者的鼻息肉組織中上調的DEGs顯著富集的生物過程，主要包括炎癥反應、免疫反應、細胞趨化性、炎癥反應的正向調節、細胞的粘附等，該結果和Yao等[12]研究結果類似，但是關鍵基因有所不同，考慮和對樣本的分析方法不同有關。在KEGG通路研究中，上調的DEGs主要在造血細胞系、細胞因子-細胞因子受體相互作用、破骨細胞分化、趨化因子信號通路等信號通路中富集，說明在通路過程中，各種細胞及細胞因子的參與和鼻息肉的形成有一定的關系。

從PPI網絡篩選出了前10個關鍵基因：ITGAM、IL10、CD86、TLR8、ITGAX、CCL2、CCR7、SRC、EGF及ITGB2。其中IL10是主要由單核細胞產生的一種重要的抗炎細胞因子。該細胞因子在免疫調節和炎癥中具有多效作用，在對微生物抗原的免疫反應中起負調控作用，另外IL10還具有防止感染過程中過度發炎的功能。幾乎所有免疫細胞(包括T細胞、B細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞)都可以發出促炎信號產生IL10[13]。在嗜酸性CRSwNP中，M2巨噬細胞產生的IL10受損可能導致持續的炎癥[14]。當暴露于金黃色葡萄球菌腸毒素B后，IL10產生受損可能會加劇嗜酸性CRS的病理生理，包括嗜酸性粒細胞增多和下呼吸道阻塞[15]。研究表明，IL10、IL10相關炎癥細胞因子及IL10相關B細胞活化的表達升高提示IL10是一種強抗炎細胞因子，在CRSwNPs的發病機制中起關鍵作用[16]。

整合素亞基Alpha M(integrin subunit Alpha M,ITGAM)是一種蛋白質編碼基因。該基因編碼整聯蛋白αM鏈。整聯蛋白是由α鏈和β鏈組成的異二聚體整體膜蛋白。αMβ2整聯蛋白在嗜中性粒細胞和單核細胞黏附于刺激的內皮細胞以及補體包被顆粒的吞噬作用中很重要。與ITGAM相關的疾病包括系統性紅斑狼瘡[17]、IgA腎病[18]和粒細胞減少癥。參與的相關途徑包括MAPK-Erk途徑和吞噬體(phagosome)的形成[13]，但是針對鼻息肉中的ITGAM的研究還沒有涉及。

CD86基因編碼的蛋白為免疫球蛋白超家族成員的I型膜蛋白。該蛋白由抗原呈遞細胞表達，它是T細胞表面上兩種蛋白質的配體，即CD28抗原和與細胞毒性T淋巴細胞相關的蛋白4(cytotoxic T-lymphocyte associated protein-4,CTLA-4)。通過結合CD28或CTLA-4，受體參與了T淋巴細胞增殖和白介素2產生的共刺激信號,可能在T細胞活化的早期事件和對幼稚T細胞的共同刺激中起關鍵作用。該蛋白與CD28抗原的結合是對T28細胞的共刺激信號。該蛋白與CTLA-4的結合會負面調節T細胞活化并減少免疫反應[13]，但是針對鼻息肉中的CD86的研究也還沒有涉及。

本研究的結果只是對來源于GEO數據庫下載的表達譜數據進行分析后獲得，芯片數據只包含24個樣本,其中鼻息肉組織和對照組織樣本量相對較少，其結果有可能出現一定偏差，因此還需要更多的臨床組織樣本來進行證實。從DEGs數據構建的PPI網絡中列出的前10個關鍵基因中，按照節點的度的高低排列后，發現篩選出的基因及通路大多數都未有基礎研究文獻供分析和驗證，因此還需要有更多研究來進一步驗證和闡明基因集富分析的結果。

綜上所述，本研究獲得的鼻息肉差異表達基因的生物信息學分析結果，雖然還需要基礎研究的數據支持，但是分析結果為鼻息肉發病機制的研究提供了新思路，為后續進一步進行基礎研究給予了較好的提示和參考作用。